La cuantificación precisa de las proteínas de una muestra es fundamental para el estudio de las mismas en infinidad de ámbitos de investigación.

Mientras que la cuantificación de una proteína específica puede llevarse a cabo mediante ensayos como Western Blot o ELISA, por espectrometría de masas (MS) o mediante otros métodos como los basados en nanopartículas, existen ensayos que permiten cuantificar la concentración de proteína total presente en una muestra.

Este último caso es en el que nos centramos esta semana, recopilando una breve descripción de los 5 principales métodos para cuantificar proteínas totales.

 

5 métodos para cuantificar proteínas

 

1.- Ácido Bicinconínico (BCA)
  • Rango de concentración: 20-2000 ug/ml
  • Características:
    • Desarrollado en 1985
    • Ensayo colorimétrico donde la absorbancia será proporcional a la concentración de proteína presente en la muestra
    • Reacción en dos pasos:
      • Formación de complejos proteína-iones de cobre
      • Formación de un quelato Cu-BCA que da lugar a una intensa coloración púrpura que absorbe a 562nm
    • Es un método recomendado en el caso de muestras que contengan >5% de detergentes y/o agentes desnaturalizantes como urea o cloruro de guanidinio.
  • Limitaciones:
    • Las muestras que contengan sustancias que interaccionan con el cobre, como por ejemplo el amoníaco, al igual que el EDTA, los azúcares reductores o los lípidos, pueden interferir con este ensayo.

 

2.- Absorción Ultravioleta (UV)
  • Rango de concentración: 0,1-100 ug/ml
  • Características:
    • Este método, mediante la medición de la absorción característica que presentan el triptófano y la tirosina a 280nm, estima la cantidad de proteína presente en la muestra.
  • Limitaciones:
    • Es incompatible con los métodos de extracción de proteínas que emplean detergentes y/o agentes desnaturalizantes.
    • No es un método específico para proteínas, ya que otros compuestos que podría haber en la muestra también absorben a 280nm (como alcoholes o ácidos nucleicos, entre otros)

 

3.- Ensayo de Bradford o azul Coomasie
  • Rango de concentración: 20-2000 ug/ml
  • Características:
    • Método descrito en 1976
    • Se caracteriza por ser un método rápido, sencillo y compatible con los agentes reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución.
    • La tinción azul Coomasie cargada negativamente, se une a proteínas con carga positiva.
    • Se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina.
    • La tinción en solución es de color rojo y absorbe a 465nm, mientras que al unirse a los aminoácidos básicos de una proteína se vuelve azul y absorbe a 595nm.
    • La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra.
  • Limitaciones:
    • No es válido para detectar proteínas de <3kDa
    • Es incompatible con detergentes como el SDS o el Triton X-100

 

4.- Ensayo de Lowry
  • Rango de concentración: 10-1000 ug/ml
  • Características:
    • Uno de los métodos para cuantificar proteínas más utilizado, fue desarrollado en 1951
    • Es un ensayo muy sensible y preciso
    • Al igual que el ensayo BCA, se da una reacción en dos pasos:
      • Formación de complejos Cu-N (presente en la proteína)
      • Los complejos de tirosina y triptófano reaccionan con el rectivo Folin-Ciocalteau, dando lugar a un color azul verdoso que absorbe entre 650 y 750nm.
    • La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra.
  • Limitaciones:
    • Es incompatible con determinados reactivos químicos de uso común como el Tris, EDTA, DDT, 2-mercaptoetanol, carbohidratos, etc.

 

5.- Ensayo CBQCA (3-(4-carboxibenzoil)quinolina-2-carboxialdehído)
  • Rango de concentración: 100 ng – 1500 ug/ml
  • Características:
    • Se trata de un agente fluorogénico de alta sensibilidad que se utiliza para la detección de aminas primarias en las proteínas.
    • La intensidad de la fluorescencia emitida será directamente proporcional a la concentración de proteína presente en la muestra.
    • No interacciona con compuestos lipídicos
  • Limitaciones:
    • El resultado depende del número de determinados aminoácidos presentes en la proteína.

 

Terminamos este post sobre métodos para cuantificar proteínas con las siguientes entradas relacionadas:

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