La concentración y el enriquecimiento de la muestra es un paso clave en el proceso de extracción y purificación de muchas proteínas. Una vez aislada la proteína de interés, en muchos casos resulta necesario proceder al enriquecimiento de la muestra incrementando su concentración antes de llevar a cabo los análisis o ensayos posteriores, muy especialmente en aquellos casos en los que la cantidad de proteína total es muy baja.
Esta semana os traemos 5 técnicas para concentrar proteínas y garantizar así que se encontrarán a la concentración óptima para la realización de los ensayos pertinentes.
5 Técnicas para concentrar proteínas
1.- Centrifugación
Se trata del método más sencillo para concentrar proteínas, pudiendo utilizarse para separar subestructuras celulares (en el caso de que la proteína de interés esté localmente concentrada), o para fraccionar una muestra de proteínas compleja, en función de su coeficiente de sedimentación.
2.- Precipitación
- Precipitación con sales neutras: en este caso se añaden grandes cantidades de sales neutras como sulfato de amonio o cloruro sódico para favorecer las interacciones que darán lugar a fenómenos de agregación y precipitación.
- Inmunoprecipitación: este método resulta especialmente útil para enriquecer proteínas poco abundantes en la muestra. La proteína de interés se incuba en este caso con beads acopladas a un anticuerpo específico.
- Precipitación isoeléctrica: en esta técnica, la precipitación se consigue variando el pH del medio, generalmente con ácido tricloroacético (TCA). Esta técnica no es recomendable en el caso en que se precise que la proteína siga siendo funcional una vez concentrada.
3.- Diálisis
En este caso, la solución que contiene la proteína diluida se coloca en una bolsa de diálisis o un dispositivo similar para dializarla frente a un polímero que absorba agua. La membrana de diálisis retendrá la proteína de interés dentro de la bolsa de diálisis, mientras el agua atraviesa la misma, logrando así una muestra más concentrada.
4.- Electroforesis
La técnica de electroforesis permite separar mezclas complejas de proteínas en una muestra en función de su tamaño, perfil y carga, pudiendo enriquecer así la muestra con la proteína de interés.
5.- Cromatografía
Se trata de un método físico que permite separar los componentes de una muestra, siendo las siguientes técnicas las más útiles para este fin:
- Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Permite separar las proteínas en función de sus cargas netas a un determinado pH. Para fraccionar proteínas ácidas, se emplea la cromatografía de intercambio aniónico, mientras que las proteínas de carácter básico se fraccionan mediante cromatografía de intercambio catiónico.
- Cromatografía de fase reversa
Permite separar las proteínas en base a su hidrofobicidad. En este caso la fase móvil es ligeramente más polar que la estacionaria, por lo que las proteínas hidrofóbicas de la fase móvil se adsorberán a la fase estacionaria, mientras que las proteínas hidrofílicas serán eluídas.
- Cromatografía de afinidad
Esta técnica se vale de interacciones biológicas altamente específicas entre la proteína de interés y un anticuerpo unido a la columna.
- Cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados
Se basa en la formación de enlaces entre los grupos básicos presentes en la superficie de la proteína y los iones metálicos. Es una técnica muy utilizada para la concentración de proteínas fosforiladas.
- Cromatografía de exclusión por tamaño
Esta última técnica permite separar las proteínas de una muestra en función de su masa molecular.
Para finalizar esta entrada sobre técnicas para concentrar proteínas, os recordamos estos posts relacionadas que podrían resultaros de interés:
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