El enzimoinmunoensayo ELISA en cualquiera de sus modalidades (directo, indirecto, competitivo, tipo sándwich…), es una técnica ampliamente utilizada en los ámbitos de la investigación y el diagnóstico para detectar y/o cuantificar biomoléculas. Aunque el protocolo para llevar a cabo este tipo de ensayos es relativamente sencillo, es necesario entender el fundamento del inmunoensayo ELISA para interpretar correctamente los resultados.
Como en cualquier otro ensayo biológico, en ocasiones los resultados pueden no ser los que uno espera. En estos casos, es fundamental prestar atención a los pequeños detalles que se nos hayan podido pasar por alto distorsionando el resultado y dando al traste con el rendimiento del inmunoensayo.
Aquí te traemos algunos consejos que te permitirán solucionar problemas en un inmunoensayo ELISA.
Cómo optimizar tu inmunoensayo ELISA y resolver los problemas más habituales
- Si la señal es anormalmente alta y las curvas estándar presentan ODs saturadas:
- Asegúrate de haber reconstituido los estándares en el volumen adecuado
- Respeta los tiempos de incubación
- Si obtienes excesivo ruido de fondo
- Lava las placas con agua destilada
- Asegúrate de que el sustrato no presenta color antes de añadirlo a la placa (podría haber sufrido cierta degradación)
- Solución de lavado correcta
- Revisa la temperatura ambiente: la óptima se sitúa entre 18-25ºC
- Asegúrate de que los reactivos se han preparado de manera correcta
- Asegúrate de que los lavados se llevan a cabo correctamente:
- Suficiente número de lavados
- Volumen de solución de lavado (al menos 400ul/pocillo)
- Si las lecturas de OD son inesperadamente bajas
- Asegúrate de que el laboratorio, los reactivos y/o las placas no están a una temperatura demasiado baja
- No sobrepases el número de ciclos de lavado
- Asegúrate de que se han cumplido los tiempos de incubación
- Revisa que las cantidades de antígeno y/o anticuerpo utilizadas sean suficientes.
- Si no obtienes coloración
- Comprueba que los reactivos se hayan utilizado en el orden correcto, y que se han llevado a cabo todos los pasos del ensayo
- Asegúrate de haber utilizado el conjugado correcto
- Comprueba que se haya añadido la solución con el sustrato
- Evita los buffer de lavado que contengan azida sódica
- Si obtienes baja reproducibilidad dentro de una misma placa
- Asegúrate de que el tiempo de adición de reactivos no se prolonga demasiado hasta completar todos los pocillos. Prepara siempre con antelación todos los reactivos necesarios y utiliza pipetas multicanal
- Asegúrate de que la pipeta multicanal funciona correctamente
- Comprueba que el sistema de lavado funcione correctamente
- Comprueba que la distribución de anticuerpo es homogénea. En caso de que las muestras hayan estado congeladas o refrigeradas, asegúrate de mezclarlas bien antes de diluirlas. Una vez diluidas vuelve a mezclarlas antes de añadirlas a la placa.
- Si los resultados no son reproducibles entre placas
- Mantén los mismos tiempos de incubación para todas las placas.
- Aplica el mismo número de lavados a cada placa
- Asegúrate de que los controles y las muestras se encuentran a la misma temperatura antes de llevar a cabo el ensayo.
- En ocasiones, podría deberse al uso de reactivos de diferentes lotes
Las causas de error en un ELISA que se repiten con más frecuencia suelen tener su origen en la instrumentación/procedimiento de lavado, la preparación de los reactivos y/o en el incorrecto cumplimiento del protocolo.
Si tu ensayo no arroja los resultados esperados, los consejos que se enumeran arriba pueden proporcionarte un buen punto de partida para solventar los problemas.
Si necesitas ayuda, contacta con nosotros.
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