El ELISA es un inmunoensayo ampliamente utilizado tanto en investigación básica como con fines diagnósticos. Sus aplicaciones van desde la detección de contaminantes en alimentos o procesos industriales a la detección y validación de biomarcadores, cuantificación de analitos o titulación de anticuerpos.
En esta entrada os traemos algunos trucos para un ensayo ELISA exitoso que os ayuden a conseguir resultados precisos, consistentes y reproducibles.
7 Trucos para un ensayo ELISA exitoso
1.- Selecciona el formato que mejor se ajuste a tus objetivos
La flexibilidad que presentan los inmunoensayos ELISA en cuanto a su diseño, permite elegir entre los distintos tipos de ensayo aquel que mejor se ajuste a los objetivos que se persiguen en cada experimento:
- ELISA directo
Es el formato más rápido y sencillo, donde la placa se tapiza con el antígeno y posteriormente se incuba con un anticuerpo conjugado. Se utiliza por ejemplo para titular anticuerpos secundarios.
- ELISA indirecto
Este método es el de uso más común, y se utiliza con frecuencia para titular anticuerpos primarios. La placa se tapiza con el antígeno al igual que en el ELISA directo, pero con la diferencia de que para la detección se emplean dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, lo que permite amplificar la señal.
Este es un ensayo que ofrece mayor sensibilidad que los anteriores, y para el que se requiere un par de anticuerpos específicos (uno de captura y otro de detección) frente al antígeno.
- ELISA competitivo
El ELISA competitivo permite determinar la especificidad de un determinado anticuerpo frente a su antígeno. También se utiliza para cuantificar antígenos o evaluar la reactividad cruzada.
2.- Prepara las muestras correctamente
Las características de las muestras que se vayan a analizar influyen directamente en las condiciones del ensayo, entre ellas:
- La complejidad de la muestra:
- Muestras homogéneas (Antígeno purificado)
- Muestras heterogéneas (Mezcla no purificada)
- La cantidad de antígeno presente esperada
En esta entrada sobre Preparación de muestras para ELISA encontraréis más detalles sobre la correcta preparación de las muestras.
3.- Selecciona los anticuerpos apropiados
En el caso de que vayas a montar tu propio ELISA, la selección de los anticuerpos es un paso crítico para un resultado exitoso.
En los inmunoensayos ELISA pueden emplearse tanto anticuerpos monoclonales como policlonales, o incluso una combinación de ambos. Es imprescindible conocer en detalle las ventajas y debilidades de cada uno de ellos a la hora de diseñar nuestro experimento.
Como ya hemos comentado en otras ocasiones, los anticuerpos monoclonales son más específicos ya que reconocen un único epítopo de un antígeno, lo que les confiere la ventaja de producir menos ruido de fondo y menor probabilidad de dar lugar a reacciones cruzadas y uniones inespecíficas.
Los anticuerpos policlonales sin embargo, reconocen varios epítopos de un mismo antígeno, lo que los hace mucho más sensibles que los anticuerpos monoclonales en detrimento de su especificidad.
En esta entrada sobre Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales encontraréis un análisis más exhaustivo de las ventajas e inconvenientes de utilizar cada uno de ellos.
4.- Elige el ELISA adecuado para tu experimento
En el caso de que optes por un kit ELISA comercial, es preciso valorar algunos factores como el tipo de muestra que se va a emplear, la especie de la que se deriva el analito de interés, o el rango de detección, entre otros.
En esta entrada os dejamos algunos consejos sobre Qué características buscar en un kit ELISA También podéis probar nuestro Buscador de kits ELISA, y por supuesto, no dudéis en contactar con nosotros si necesitáis que os asesoremos en este aspecto.
5.- Evita la contaminación cruzada
Al igual que cualquier otro método analítico, los inmunoensayos ELISA son susceptibles de sufrir contaminación si los reactivos y/o la instrumentación no se manejan adecuadamente.
La contaminación cruzada puede darse en cuatro direcciones:
- De muestra a muestra
En caso de que se manejen distintas muestras en un mismo ensayo, los restos de una podrían transmitirse a otra por arrastre, dando lugar a resultados falsos positivos. Este tipo de contaminación se evita cambiando las puntas de pipeta después de cada muestra.
- De la pipeta a la muestra
Si bien las puntas o la propia pipeta están contaminadas, pueden contaminar las muestras en las que se introducen. Para evitarlo, se debe cambiar la punta después de cada muestra, usar solo puntas nuevas o correctamente esterilizadas o autoclavar las partes de la pipeta que entren en contacto con la muestra.
- De la muestra a la pipeta
Para evitarlo, la pipeta debe mantenerse en posición vertical tanto durante el pipeteado como durante el almacenamiento, además de soltar el émbolo lentamente al depositar la muestra.
- De pocillo a pocillo
Para evitarlo, se debe prestar especial atención a los pasos de lavado, asegurándose entre otras cosas de no llenar demasiado los pocillos con el buffer de lavado.
6.- Construye una curva patrón fiable
Uno de los trucos para un ensayo ELISA exitoso radica en la importancia de construir una curva patrón para cada ensayo o placa que se analice, ya que factores como la variación entre operarios, las condiciones de incubación o las pipetas utilizadas en cada caso, pueden hacer que la misma curva realizada en dos momentos distintos no refleje exactamente los mismo valores de OD.
Aquí te contamos Cómo hacer una curva patrón para ELISA.
7.- Optimiza los resultados
Una vez realizado el ensayo, los resultados pueden reflejar valores inesperados: señal excesivamente alta o baja, ausencia de señal, excesivo ruido de fondo o baja reproducibilidad, entre otros.
Es importante optimizar cada ensayo para obtener los resultados adecuados, y para ello os dejamos estos 6 Tips para solucionar problemas en un inmunoensayo ELISA.
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