La técnica de inmunofluorescencia (IF), basada en la detección de un determinado antígeno de interés mediante la utilización de anticuerpos marcados con fluorescencia, es una técnica de amplio uso en los laboratorios de investigación debido a su sencillez y fiabilidad.

Los resultados pueden visualizarse mediante microscopía de fluorescencia utilizando longitudes de onda cortas y permite, además de detectar la presencia o ausencia de una determinada proteína en la muestra, determinar su distribución en la misma o confirmar la presencia de modificaciones postraduccionales, entre otros.

En esta entrada os traemos algunas claves relacionadas con los anticuerpos para inmunofluorescencia que pueden ayudaros a optimizar los resultados de vuestros ensayos.

 

3 claves a la hora de utilizar anticuerpos para Inmunofluorescencia

 

1.- La importancia de la especificidad de los anticuerpos para inmunofluorescencia

Como en cualquier otro inmunoensayo, la especificidad del anticuerpo primario frente a nuestro antígeno diana es un factor determinante en la fiabilidad y el éxito en los resultados. Cuanto más específico sea el anticuerpo, mejor será la señal obtenida y menor el ruido de fondo generado.

Recordemos también que un anticuerpo que presenta una alta especificidad frente a un antígeno en una determinada técnica no tiene por qué hacerlo en otra, aunque se trate del mismo antígeno. De ahí la importancia de validar cada anticuerpo para cada técnica en la que se vaya a utilizar. En el caso que nos ocupa, es primordial validar previamente los anticuerpos para inmunofluorescencia que se vayan a emplear en el ensayo.

¿Cómo podemos validar los anticuerpos para inmunofluorescencia? Pues existen diversos métodos como experimentos de expresión positiva y negativa utilizando por ejemplo líneas celulares knock-out, mediante manipulación experimental de la localización de la proteína diana, optimizaciones de protocolo, etc. O bien, recurriendo a anticuerpos comerciales ya validados para su uso en esta técnica.

 

2.- Controles para inmunofluorescencia

La inclusión de controles, como en cualquier otro experimento, incrementará la confianza en los resultados obtenidos en cuanto a especificidad y sensibilidad.

Para evitar errores derivados de fenómenos de autofluorescencia o de uniones no específicas de los anticuerpos, es muy importante el uso de controles negativos en los ensayos de inmunofluorescencia.

Adicionalmente, pueden incluirse controles adicionales como la omisión del anticuerpo primario, el uso de controles de isotipo y de líneas celulares negativas y positivas para el antígeno de interés.

 

3.- Dilución de los anticuerpos para inmunofluorescencia

Para optimizar los resultados de los ensayos, otro de los puntos clave es la titulación de los anticuerpos para determinar la dilución idónea a emplear en cada caso. Esta variará también en función de si lo que manejamos es un anticuerpo purificado o un antisuero.

En este sentido, es importante conseguir un buen ratio señal/ruido de fondo, es decir, una óptima relación entre la intensidad de la señal fluorescente proveniente del antígeno de interés y la señal de fondo debida a uniones inespecíficas. Si aplicamos el anticuerpo primario a muy baja concentración, será muy difícil distinguir la señal positiva. Y por el contrario, un anticuerpo demasiado concentrado incrementará en exceso el ruido de fondo.

Los rangos de concentración/dilución típicos para experimentos de inmunofluorescencia suelen estar entre 1-10ug/mL en el caso de utilizar anticuerpos purificados, y entre 1:100 – 1:1000 para los antisueros.

En esta entrada podéis recordar algunas otras diluciones recomendadas para otras técnicas e inmunoensayos.

 

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