El Western Blot se lleva a cabo mediante un proceso en tres fases: la electroforesis en gel (que permitirá separar las proteínas presentes en la muestra), la transferencia a la membrana y la adición de un anticuerpo específico que permita detectar la proteína de interés.
Los anticuerpos juegan un papel fundamental en la resolución exitosa de este inmunoensayo, por lo que la correcta elección de los anticuerpos para Western Blot se convierte en un punto crítico a la hora de realizarlos.
Consideraciones generales para elegir anticuerpos para western Blot
1.- Interacción Antígeno-Anticuerpo
Al llevar a cabo un Western Blot en condiciones desnaturalizantes, conviene tener en cuenta dos puntos importantes:
- Los anticuerpos que reconocen epítopos conformacionales pueden perder esta afinidad si la proteína se desnaturaliza.
- Los anticuerpos que reconocen epítopos lineales en condiciones desnaturalizantes, pueden no detectarlos en la estructura nativa de la proteína, entre otros, por motivos de impedimento estérico por ejemplo.
2.- ¿Anticuerpos policlonales o monoclonales?
O en otras palabras, ¿sensibilidad o especificidad? En términos generales, los anticuerpos policlonales son más sensibles que los monoclonales, lo que resulta especialmente relevante si se pretenden detectar proteínas poco abundantes en la muestra.
Los anticuerpos monoclonales sin embargo, debido a su naturaleza homogénea, son mucho más específicos por lo que suelen originar menor ruido de fondo y menores problemas de reactividad cruzada que los policlonales.
Para profundizar en este tema, te recordamos este post sobre las Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales
3.-Método de detección
En el caso de los anticuerpos secundarios, la elección de los anticuerpos para Western Blot también se verá condicionada por el método de detección que vayamos a utilizar para visualizar la presencia de la proteína de interés, ya que estos deberán ir marcados de distinta forma en función de que la detección se lleve a cabo por colorimetría o mediante quimioluminiscencia.
Con todo ello, podemos concluir que la clave para obtener un resultado fiable y consistente en Western Blot reside en la interacción antígeno-anticuerpo, y por lo tanto, la elección de los anticuerpos para Western Blot no debe hacerse solo en base al inmunoensayo, sino atendiendo además a los aspectos específicos de nuestro experimento como las condiciones del ensayo, la naturaleza del antígeno o el método de detección utilizado.
Para terminar, te recordamos estas entradas relacionadas que pueden resultarte de interés:
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