El uso de agentes de bloqueo de la membrana en Western Blot es un paso crítico para prevenir las uniones no específicas de nuestro anticuerpo, bloqueando los puntos de la membrana que no contienen ligando.
Los agentes de bloqueo de la membrana en Western Blot que se utilizan con mayor frecuencia son la BSA (Albúmina se suero bovino) o la leche. ¿Pero qué diferencias, ventajas e inconvenientes existen entre usar uno o el otro?
La elección entre la albúmina de suero bovino (BSA) y la leche desnatada depende de factores genéricos como el precio o la disponibilidad, pero también de criterios más específicos como el tipo de proteína que estemos analizando, su nivel de expresión o la fuerza de unión del anticuerpo. Lo analizamos a continuación.
¿BSA o LECHE PARA BLOQUEAR LA MEMBRANA EN WESTERN BLOT?
Como comentábamos en la introducción, el primer criterio a tener en cuenta a la hora de seleccionar el agente de bloqueo que mejor se ajuste a nuestro experimento de Westren Blot es la capacidad de unión del anticuerpo y el nivel de expresión de la proteína.
A grandes rasgos, la leche es el agente de bloqueo de elección cuando queremos ajustar el presupuesto y recurrir a un reactivo de mayor disponibilidad, siempre y cuando los anticuerpos que estemos utilizando tengan una buena capacidad de unión al antígeno, y la proteína de interés se encuentre en niveles relativamente altos en la muestra.
Por el contrario, la BSA (Albúmina de suero bovino) se suele utilizar en el caso de anticuerpos con capacidad de unión más limitada o cuando disponemos de baja cantidad de proteína en la muestra problema.
En segundo lugar, hay que tener siempre presente que mientras la BSA es una única proteína purificada, la leche está compuesta por una mezcla de proteínas distintas. Por lo tanto, en el caso de utilizar anticuerpos fosfoespecíficos, se recomienda usar BSA como agente de bloqueo de la membrana en western Blot, debido a que la leche contiene proteínas fosforiladas (p.e. caseína) que podrían reaccionar de manera inespecífica con el anticuerpo.
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE USAR BSA FRENTE A LECHE
Dicho lo anterior, podemos resumir las ventajas e inconvenientes del uso de BSA vs Leche como agentes de bloqueo de la membrana en Western Blot de la siguiente manera:
| AGENTE DE BLOQUEO | VENTAJAS | INCONVENIENTES |
| BSA |
· Menor riesgo de reactividad cruzada · Resultados más específicos y limpios · Permite su uso con proteínas fosforiladas · Apto para el uso con proteínas presentes en bajos niveles |
· Producto de mayor coste · Los carbohidratos que contiene pueden incrementar el ruido de fondo en presencia de lectina |
| LECHE |
· Más económico · Mayor capacidad de bloqueo · Fácil de adquirir y preparar |
· No se recomienda su uso con anticuerpos fosfoespecíficos · No puede utilizarse en experimentos basados en estreptavidina-biotina (la leche contiene biotina) · Reduce la sensibilidad de algunos anticuerpos anti-HIS comerciales · Puede enmascarar las proteínas que se encuentren en bajas cantidades en la muestra |
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