Los kit ELISA, diseñados para determinar la presencia y/o concentración de un determinado antígeno en una muestra problema, son inmunoensayos que pueden ser diseñados en el propio laboratorio. Para ello, es necesario adquirir los distintos componentes (placas, anticuerpos, buffers…), y poner a punto un protocolo funcional mediante ajustes y ensayos bajo distintas variables hasta lograr optimizarlo.
En ocasiones, esto supone un proceso complejo, costoso y laborioso, por lo que recurrir a kits comerciales ya puestos a punto para la realización del inmunoensayo puede resultar una buena opción. Si este fuera el caso, ¿cuáles serían las características más importantes que deberíamos tener en cuenta para elegir un kit ELISA más adecuado?
En este post te explicamos cuatro de los aspectos más importantes en los que nos debemos fijar a la hora de comprar un kit ELISA comercial.
Factores a considerar para elegir un kit ELISA
1.- Formato del ensayo
En base a aspectos como la flexibilidad, sensibilidad, complejidad de la muestra o los resultados que queramos alcanzar, podemos optar por distintos tipos de kit ELISA que mejor se ajusten a nuestras necesidades.
ELISA DIRECTO
- Fundamento: El antígeno se inmoviliza en una placa de micropocillos, para ser después detectado directamente mediante un anticuerpo conjugado, por ejemplo, a una enzima como HRP.
- Puntos fuertes:
- Rapidez
- Menor probabilidad de cometer errores durante el ensayo, debido al menor número de pasos y reactivos utilizados.
- Puntos débiles:
- Puede generar mayor ruido de fondo debido a que todas las proteínas de la muestra pueden quedar inmovilizadas en la placa (tanto nuestro antígeno de interés como el resto), resultando en inespecificidad.
- Menor flexibilidad, ya que requiere el uso de un anticuerpo primario específico conjugado para cada antígeno de interés.
- Menor sensibilidad, debido a que no existe amplificación de la señal.
- Uso más frecuente: Para analizar la respuesta inmune frente a un determinado antígeno.
ELISA INDIRECTO
- Fundamento: En este caso, el antígeno que se inmoviliza sobre la placa es posteriormente detectado en dos pasos. Primero, un anticuerpo primario sin marcar se une específicamente al antígeno, y después, se añade un anticuerpo secundario conjugado a una enzima que se unirá al primario, amplificando la señal. (Recuerda esta guía para seleccionar los anticuerpos secundarios).
- Puntos fuertes:
- Alta sensibilidad, ya que varios anticuerpos secundarios conjugados pueden unirse a un mismo anticuerpo primario.
- Mayor flexibilidad, siendo posible el uso de diferentes anticuerpos primarios con un único secundario conjugado.
- Puntos débiles:
- Posible reactividad cruzada por el uso de anticuerpos secundarios que podrían incrementar el ruido de fondo.
- El procedimiento es más largo que en un ELISA directo, con pasos de incubación adicionales.
- Uso más frecuente: Para determinar la concentración total de anticuerpo en una muestra.
ELISA SANDWICH
- Fundamento: Este ensayo requiere el uso de parejas de anticuerpos primarios que reconozcan distintos epítopos de un mismo antígeno. La placa se tapiza con uno de ellos, que actuará como anticuerpo de captura. Posteriormente, se añadirá la muestra con el analito de interés, y finalmente el segundo anticuerpo que actuará como anticuerpo de detección. Este anticuerpo de detección puede estar marcado con una enzima (ELISA sándwich directo), o sin marcar haciendo uso posterior de un anticuerpo secundario conjugado (ELISA sándwich indirecto).
- Puntos fuertes:
- Alta sensibilidad
- Alta especificidad, por el uso de dos anticuerpos primarios
- Flexible, pudiendo detectarse la señal por método directo o indirecto.
- Puntos débiles:
- No siempre es sencillo conseguir un par de anticuerpos adecuado, pudiendo dar lugar a reactividad cruzada entre ambos. (Recuerda las claves para seleccionar pares de anticuerpos).
- Uso más frecuente: Para el análisis de muestras complejas, ya que no es necesario purificar previamente el antígeno.
2.- Anticuerpos
- Valorar el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales. Ambos son válidos para llevar a cabo ensayos ELISA, primando los policlonales cuando se busca sensibilidad, y los monoclonales en caso de importar más la especificidad. En el ELISA tipo sándwich es frecuente emplear un anticuerpo policlonal para captura y un anticuerpo monoclonal para detección. (Recuerda las diferencias entre monoclonales y policlonales).
- En el caso del ELISA tipo sándwich, es preciso asegurarse de que se cuenta con un par de anticuerpos validados para tal fin. Es decir, que reconozcan distintos epítopos no solapantes dentro de un mismo antígeno.
3.- Reactividad cruzada e interferencias
- Para evitar problemas de reactividad cruzada en los ELISA tipo sándwich, conviene que cada uno de los anticuerpos primarios haya sido generado en un host diferente. De esta manera, el anticuerpo secundario reaccionará únicamente con el anticuerpo primario de detección.
- Conviene también prestar atención a la composición de los buffers del kit ELISA, por si pudieran contener compuestos que puedan interferir en la unión antígeno-anticuerpo.
4.- Método de detección
- Otro aspecto a valorar antes de elegir un kit ELISA es el método de detección que se desee emplear. En la actualidad los kit ELISA pueden utilizar formas de detección radioactivas, fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicas.
Antes de comprar un kit ELISA es importante prestar atención a los cuatro aspectos que hemos resumido en esta entrada, y que esperamos os hayan resultado de ayuda. En caso de duda, no dudéis en contactar con nosotros y os asesoraremos al respecto.
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