No todos los anticuerpos funcionan de manera óptima en todas las técnicas. El mismo anticuerpo monoclonal que nos da excelentes resultados en nuestros ensayos de citometría de flujo, puede resultar inútil, por ejemplo, en Western Blot. Una de las claves para obtener buenos anticuerpos para una determinada aplicación, radica en la correcta elección del antígeno (péptido, proteína recombinante…) que se utilizará en la fase de inmunización.
Mientras que en técnicas como el Western Blot, inmunohistoquímica o inmunoensayo ELISA directo los anticuerpos reconocen epítopos generalmente desnaturalizados, en otras como el ELISA tipo sandwich, citometría de flujo, inmunofluorescencia, etc. reconocerán epítopos conformacionales.
Como norma general, los anticuerpos policlonales son más versátiles, dando buenos resultados en un mayor número de técnicas, mientras que los anticuerpos monoclonales suelen resultar más técnica-específicos.
Sea cual sea el caso, siempre existe un denominador común: el diseño y la calidad del antígeno utilizado para la generación de los anticuerpos, junto con los protocolos de inmunización, inciden directamente en la aptitud del mismo para una técnica concreta.
Claves para obtener buenos anticuerpos: diseño del antígeno en función del tipo de ensayo
1.Western Blot
En Western Blot la proteína diana se encuentra desnaturalizada de manera irreversible por la aplicación de SDS, desapareciendo su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria. Por ello, los antígenos recomendados son:
- Péptidos
- Fragmentos de proteína
- Proteína recombinante
Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales suelen funcionar bien en Western Blot.
Los anticuerpos frente a un antígeno conformacional (sobre todo los monoclonales), no darán buenos resultados en esta técnica.
2. ELISA directo
La proteína o el péptido diana se inmoviliza sobre la superficie sobre la que se titula el anticuerpo. Es importante prestar atención a la pureza del antígeno, ya que las impurezas competirán con él para unirse a la fase sólida.
También hay que tener en cuenta, que al inmovilizar el antígeno directamente sobre la superficie, algunos epítopos pueden quedar ocultos o inaccesibles al anticuerpo.
Es recomendable utilizar un antígeno distinto al empleado para inmunizar (por ejemplo, si se ha inyectado a los animales una proteína recombinante, realizar el screening frente a la proteína nativa).
3. ELISA Sándwich
Un anticuerpo inmovilizado sobre una superficie captura el antígeno presente en la muestra, y éste a su vez reacciona con un segundo anticuerpo también específico frente al antígeno.
El anticuerpo secundario se conjuga (a una enzima, fluorocromo…) para posibilitar la detección.
El antígeno se presenta en su forma “nativa”, por lo que generalmente se requiere la utilización de anticuerpos que reconozcan epítopos conformacionales. Por ello, generar anticuerpos frente a péptidos no suele dar buenos resultados en esta técnica, y se recomienda el uso de:
- Fragmentos de proteína
- Proteína recombinante
- Antígeno nativo purificado
Al utilizar dos anticuerpos, la reacción es mucho más específica, aunque la especificidad estará limitada por el anticuerpo de menor afinidad.
Tanto los policlonales como los monoclonales son aptos para su uso en esta técnica, incluso pueden utilizarse de manera combinada.
4. Inmunohistoquímica
Los anticuerpos se utilizan para teñir secciones de tejidos. El proceso al que se someten estos tejidos ( fijadores tipo formaldheido, embebidos en parafina…), suelen alterar la conformación del antígeno. Existen protocolos para recuperar el antígeno antes de proceder a la tinción, pero algunos de ellos pueden influir en la reactividad.
Los antígenos recomendados en este caso son:
- Péptidos
- Proteína recombinante
- Fragmentos de proteína
5. Citometría de flujo
- En esta técnica, sólo funcionarán los anticuerpos que reaccionen frente a los antígenos conformacionales expuestos en la superficie celular. Es fundamental seleccionar un buen antígeno conformacional que incluya las correspondientes modificaciones postraduccionales. Los inmunógenos ideales serían:
- Proteínas recombinantes
- Antígenos expresados en células o en fracciones de membrana plasmática.
Por motivos de especificidad, en citometría de flujo es preferible el uso de anticuerpos monoclonales.
6. Ensayos celulares
En este caso, en principio, se aplicarían los mismos criterios que en la citometría de flujo. Teniendo en cuenta que en una fracción policlonal podría haber anticuerpos con actividad agonista mezclados con otros que presenten actividad antagonista, en ensayos de actividad celular siempre es preferible el uso de anticuerpos monoclonales.
La obtención de anticuerpos que funcionen correctamente en nuestros ensayos depende de múltiples factores, pero sin duda, una de las claves para obtener buenos anticuerpos consiste en seleccionar, diseñar y obtener el antígeno óptimo en función de la aplicación prevista.
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Fuente imagen: Flickr (Wellcome images)
