En función del tipo de ensayo que vayamos a realizar, la elección del tipo de antígeno resulta crucial para la obtención de anticuerpos funcionales, bien sean anticuerpos monoclonales o policlonales. En determinados casos, la inmunización con proteínas completas puede no ser la mejor opción, teniendo que recurrir a la inmunización con péptidos sintéticos. Algunos de estos casos se dan cuando:
- Existe una alta homología entre nuestra proteína diana y otras proteínas que puedan estar presentes en la muestra.
- Existen dificultades para expresar y purificar el antígeno recombinante o para obtenerlo en su forma nativa.
- Se quiere obtener anticuerpos específicos frente a modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, anticuerpos fosfoespecíficos).
A la hora de diseñar un buen antígeno peptídico, es necesario prestar atención a algunos parámetros para evitar, entre otras cosas, seleccionar epítopos que no estén expuestos en la proteína nativa, y evitar posibles reacciones cruzadas con otras proteínas.
Claves para diseñar un buen antígeno peptídico
A continuación resumimos una selección de los criterios más importantes a tener en cuenta a la hora de diseñar un buen antígeno peptídico.
1.- Longitud de la secuencia
Aunque, en principio, las secuencias muy cortas generen anticuerpos con una mayor especificidad, es menos probable que esas secuencias se encuentren expuestas en la estructura de la proteína nativa. Y por el contrario, cuanto más larga sea la secuencia, menos específico será el anticuerpo resultante, pero aumentará la probabilidad de que este reconozca la proteína nativa.
Por ello es importante buscar el equilibrio entre estos dos aspectos, siendo lo habitual el uso de secuencias de entre 10 y 20 aminoácidos.
2.- Exposición de los epítopos
Es importante que la secuencia peptídica que vayamos a sintetizar se encuentre en una región expuesta, y por lo tanto accesible, de la proteína. Para ello es necesario estudiar tres aspectos:
- Secuencias hidrófilas
- Habitualmente, las proteínas nativas presentan residuos hidrófilos en la superficie, mientras que los hidrófobos suelen mantenerse en el interior de la estructura.
- Extremo N- o C-terminal
- Los extremos de la proteína, tanto el N- como el C-terminal, suelen estar generalmente expuestos en las conformaciones nativas.
- Estructura secundaria
- El análisis de la estructura secundaria de la proteína nos ayudará a seleccionar una secuencia potencialmente expuesta e inmunogénica, así como a evitar regiones complejas e inaccesibles (hélices alfa, láminas beta…).
3.- Epítopos lineales vs. Epítopos conformacionales
Los epítopos lineales son aquellos formados por una sucesión contigua de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína, mientras que los conformacionales están compuestos por secuencias de aminoácidos no contiguas procedentes de distintas secuencias polipeptídicas que se solapan al plegarse la estructura proteica en su conformación nativa.
Los anticuerpos anti-péptido suelen dirigirse a epítopos lineales, ya que es muy difícil que un péptido de tan corta longitud presente una estructura secundaria que se ajuste a la que formaría el epítopo conformacional.
4.- Conjugación a carriers
Los péptidos suelen ser demasiado pequeños para inducir una respuesta inmune por sí mismos, por lo que es necesario conjugarlos a un carrier capaz de estimular las células T helper e inducir dicha respuesta. Los anticuerpos no específicos que se generen frente a estas proteínas carrier, pueden eliminarse durante el screening o la purificación.
5.- Residuos
Respecto a los aminoácidos que compongan la secuencia seleccionada, conviene tener en cuenta las siguientes indicaciones:
- Es necesario añadir una cisteína (al extremo N-terminal si el péptido se deriva del extremo C-terminal de la proteína y viceversa), para su posterior conjugación al carrier.
- Evitar las cisteínas internas en la secuencia peptídica (pueden sustituirse por serinas).
- Evitar múltiples serinas o prolinas en la misma secuencia (no más de tres residuos), así como múltiples glutaminas para evitar la formación de puentes de hidrógeno entre péptidos.
La clave del éxito en la obtención de un anticuerpo anti-péptido es el diseño de la secuencia peptídica que se utilizará para la inmunización de los animales. Esperamos que esta guía os haya resultado de utilidad para revisar los aspectos fundamentales para diseñar un buen antígeno peptídico.
Si tienes cualquier duda respecto a la síntesis de péptidos o la producción de anticuerpos anti-péptido, no dudes en contactar con nosotros.
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