Los geles SDS-PAGE son una técnica básica y de uso común en la mayoría de laboratorios de investigación. Su utilización está dirigida a la separación de las proteínas presentes en una muestra en función de su peso molecular. Esta separación se fundamenta en la distinta velocidad de migración de las proteínas a través de un gel de poliacrilamida al aplicar un campo eléctrico.

En esta entrada recogemos algunos trucos y consejos sobre cómo hacer un SDS-PAGE de manera óptima.

 

Cómo hacer un SDS-PAGE: Trucos y Consejos

1.- Prepara los reactivos con antelación. Puedes hacerlo con todos aquellos que sean susceptibles de ser almacenados y utilizados durante algún tiempo sin deteriorarse.

  • Buffers: Se puede preparar una solución concentrada, y diluir una pequeña cantidad para cada experimento.
  • Persulfato amónico: Si se va a utilizar con frecuencia, puede almacenarse a 4ºC durante cerca de un mes. Para periodos de tiempo superiores puede alicuotarse y congelarse a -20ºC.
  • Geles: Los geles también pueden prepararse con antelación y almacenarse refrigerados (4ºC) durante 10-15 días. En este caso es fundamental asegurarse de que se mantengan húmedos hasta su uso.
  • Muestras: Pueden preparase y congelarse a -20ºC durante algunos meses. De esta manera, una vez descongeladas, estarán listas para su carga en el gel.

2.- Sustituye el agua destilada por isopropanol para cubrir el gel. Esto permitirá que el gel polimerice más rápido.

3.- Asegúrate de mantener el nivel de buffer adecuado en los pocillos. Si el volumen de buffer baja demasiado, los pocillos se secarán y el gel no correrá correctamente.

4.- Prepara el gel de poliacrilamida en función del peso molecular de las proteínas que te interese separar. Las proteínas con mayor peso molecular se mueven más despacio a través de los poros del gel. El tamaño de esos poros se puede modular dependiendo del tamaño de las proteínas que se quieran separar, cambiando la concentración de poliacrilamida según los siguientes rangos orientativos:

Peso molecular de las

proteínas a separar

% poliacrilamida

3-100 kDa

15%

10-200 kDa

12%

20-300 kDa

10%

50-500 kDa

7%

 

Para mezclas de proteínas con un mayor rango de peso molecular, se pueden utilizar geles en gradiente con capas de concentración creciente de poliacrilamida.

5.- Si estás corriendo muestras sensibles (por ejemplo complejos de proteína-RNA), pulveriza las placas con etanol (70%) y agua DEPC (dietilpirocarbonato), y asegúrate de que estén bien secas antes de comenzar.

6.- Ojo con la potencia eléctrica. Aunque a mayor potencia aumenta la velocidad de migración de las muestras, también se incrementa la probabilidad de sobrecalentamiento del gel. Para evitarlo, consulta las instrucciones del fabricante y adáptate al voltaje recomendado.

7.- Las temperaturas altas o irregulares a lo largo del gel afectan directamente a la migración de las muestras. Existen varias formas de mantener la temperatura baja, entre ellas, rellenar la parte externa del tanque con el buffer hasta el fondo de los pocillos para que el calor se disperse de forma homogénea a lo largo del gel.

 

Para terminar esta entrada sobre cómo hacer un SDS-PAGE, te dejamos estos links a entradas anteriores que podrían resultarte de interés:

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