Al trabajar con proteínas, el uso de muestras impuras o de baja calidad pueden llevar a la formación de agregados, precipitados, plegamiento incorrecto, pérdida de actividad o incluso hidrólisis de las mismas, resultando en experimentos inexactos o de baja precisión.

En esta entrada repasamos algunos métodos para evaluar la pureza de nuestra muestra y veremos cómo medir la calidad de las proteínas presentes en la misma.

 

Cómo medir la calidad de las proteínas

 

Para evaluar la calidad de las proteínas, debemos examinar tres aspectos fundamentales de las mismas: Pureza e integridad, homogeneidad y actividad.

1.- Cómo medir la pureza e integridad de las proteínas

Antes de llevar a cabo cualquier experimento con una muestra de proteína, resulta fundamental evaluar cualidades como la pureza y la integridad. Para ello, podemos hacer uso de distintas técnicas como:

  • Electroforesis

La proteína migra a lo largo del gel en función de su peso molecular, lo que permitirá detectar la presencia de contaminantes o fenómenos de proteólisis, entre otros.

  • Espectroscopía UV-visible

Aunque esta técnica suele utilizarse habitualmente para medir la concentración de proteína, también resulta útil para la detección de contaminantes no proteicos presentes en la muestra. Esto es posible siempre y cuando la proteína de interés contenga residuos aromáticos y se monitorice la absorbancia en un espectro amplio.

  • Espectrometría de masas

Mediante este método analizamos la estructura primaria de la proteína, lo que nos permitirá identificar si la proteína ha sufrido fenómenos como, por ejemplo, proteólisis. Así mismo, permite confirmar la presencia de modificaciones postraduccionales como glicosilaciones, fosforilaciones, acetilaciones, etc. en la proteína.

 

2.- Cómo medir la homogeneidad de las proteínas

Una vez determinada la pureza e integridad de nuestra muestra de proteína, es preciso evaluar si estas se encuentran homogéneamente distribuidas en la muestra y no, por ejemplo, formando agregados. Veamos qué técnicas pueden emplearse con este fin:

  • Dispersión de luz dinámica (DLS)

Esta técnica utiliza una luz láser polarizada que permite medir el nivel de difracción en una muestra. La dispersión será proporcional al radio hidrodinámico de las partículas en solución presentes en la muestra, lo que permite identificar la presencia de pequeñas cantidades de agregados.

  • Espectroscopía UV-visible y de fluorescencia

La técnica UV-visible nos permite obtener información cualitativa sobre la presencia de agregados en la muestra de una manera sencilla, simplemente monitorizando la absorbancia por encima de 320nm. En caso de señal, se confirma la presencia de agregados.

Como alternativa, podemos recurrir también a la espectroscopía de fluorescencia. En este caso, se mide el índice de agregación (AI), que es el ratio de intensidades emitidas por la muestra a 280nm y 340nm. En el caso de una muestra libre de agregados, este índice debe ser cercano a cero.

  • Cromatografia de exclusión por tamaño

Es la técnica de separación estándar para identificar y cuantificar los oligómeros de proteínas presentes en la muestra.

 

3.- Cómo medir la actividad de las proteínas

Para finalizar, una vez comprobada la pureza, integridad y homogeneidad de la proteína en la muestra, llega el turno de evaluar la actividad biológica y funcionalidad de la misma, en el caso de que esto sea un requisito para nuestro ensayo.

Las causas que pueden originar que la proteína no sea funcional van desde un plegamiento incorrecto durante la fase de expresión recombinante, hasta la interferencia con secuencias adicionales como un tag.

Para determinar la concentración de proteína activa o funcional en la muestra, existe múltiples ensayos específicos como ensayos de proliferación celular, ensayos enzimáticos o ELISAs funcionales, que se basan generalmente en las propiedades catalíticas o en la capacidad de unión de la proteína de interés para determinar el nivel de actividad biológica de la misma.

 

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