Como muchos ya sabréis y hemos comentado en otras ocasiones en el blog, la técnica de Western Blot es de mucha utilidad ya que combina la capacidad de resolución de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de los ensayos enzimáticos. Aunque todo el proceso en sí se debe hacer con sumo cuidado, el factor clave de este proceso es la capacidad del anticuerpo primario de detectar la proteína de interés.

Teóricamente, el anticuerpo debería unirse únicamente a la proteína a la que va dirigida y, por tanto, el grosor de la banda debería corresponder a la cantidad de proteína que haya presente en nuestro experimento. Sin embargo, muchas veces, aparecen más bandas por encima o por debajo de nuestra proteína de interés, lo que hace que la cuantificación sea más complicada.

En nuestro blog, hemos realizado algunos posts donde hablábamos sobre cómo validar anticuerpos, pero en este caso, nos centraremos en cómo validar un anticuerpo monoclonal o policlonal para la transferencia en Western Blot.

Para ello hay que seguir varios pasos:

 

1. Elegir un anticuerpo primario:

La precisión de los resultados de Western Blot depende en gran medida de la calidad del anticuerpo primario empleado.

La elección del anticuerpo primario depende de varios factores:

  • El antígeno que queramos detectar.
  • El plegamiento de la proteína de interés, ya que, dependiendo de cómo esté plegada, los epítopos que están expuestos varían.

En este caso, tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales funcionan muy bien.

Este anticuerpo debe ser lo suficientemente específico, sensible y reproducible para detectar la proteína diana, usando la concentración más baja de la misma. Concentraciones elevadas pueden dar lugar a bandas inespecíficas o intensidades de señal excesivas, que nos impedirán cuantificar de manera eficiente esta proteína.

 

2. Validar un anticuerpo monoclonal o policlonal:

La validación de anticuerpos es un proceso en el que se demuestra, mediante técnicas de laboratorio específicas, que las características de rendimiento de un método analítico son adecuadas para el uso previsto que se le quiera dar. Por lo que es un proceso en el que se analizan los anticuerpos primarios para determinar su sensibilidad, especificidad y reproducibilidad en el contexto en el que van a ser usados.

Según el grupo de trabajo internacional para la validación de anticuerpos (IWGAV), para validar anticuerpos destinados a la realización de Western Blot se pueden realizar varias técnicas:

  • Validación genética
  • Validación de expresión recombinante
  • Validación de anticuerpos independientes
  • Validación ortogonal
  • Validación de captura de MS

 

Validación genética: Niveles siRNA

Comparar intensidades de tinción de los anticuerpos con los datos de un secuenciador de RNA de las mismas muestras sobre diferentes tejido o células con expresiones variables de nuestra proteína de interés. Se considera que el anticuerpo es específico cuando su señal coincide con los niveles de RNA de las muestras analizadas.

 

Validación genética: Modelos KO

Funcionan como un control negativo. Se compara nuestra muestra con una muestra negativa de un tejido que no expresa la proteína de interés, en células o animales noqueados (CRISPR) o también se puede hacer en animales genéticamente ablacionados (RNAip).

 

Validación de anticuerpos independiente: IHC e ICC

Este método se basa en comparar los niveles de tinción utilizando dos anticuerpos independientes sin epítopos superpuestos. Para ello, se estudia la proteína en tejidos (IHC) o células (ICC) que expresen la proteína de interés a niveles diferentes.

Habría que comparar los anticuerpos en un conjunto de tejidos relevantes. Si generan un patrón de tinción similar, estos se validan entre sí, ya que el anticuerpo reconoce la proteína correcta en función de la localización celular.

 

Validación de expresión recombinante: Tratamiento celular

Nivel de expresión proteica manipulado dentro de las células.

Por ejemplo, se podría sobreexpresar la proteína objetivo en una línea celular que no exprese la proteína de interés. Se realizará una evolución de la tinción del anticuerpo analizando muestras de lisados celulares con y sin expresión recombinante de la proteína diana. De esta forma, si no aparece una banda o la banda es muy débil, corresponderá con el lisado de la línea celular no modificada; y una banda fuerte en la línea celular con expresión recombinante.

 

Validación ortogonal: Espectrometría de masas

Habría que comparar el patrón de tinción y el tamaño de la proteína detectada por el mismo anticuerpo mediante captura de espectrometría de masas (MS).

Los anticuerpos se consideran mejorados cuando la intensidad de tinción y los niveles de expresión de proteínas muestran el mismo patrón, lo que significará que el anticuerpo está interactuando directamente con la proteína objetivo.

Para este método es recomendable utilizar al menos dos muestras de células o tejidos, de forma que la proteína de interés exprese el objetivo a diferentes niveles.

 

Validación de captura de MS

En este caso se compara el peso molecular de la banda del anticuerpo y el tamaño de la proteína obtenida por captura MS, en el que se corta el gel de electroforesis y se analiza cada muestra por separado mediante proteómica. Las proteínas de cada corte del gel se digieren para formar péptidos.

La banda relacionada con el anticuerpo debe ser equivalente a la proteína objetivo prevista y su péptido o péptidos.

 

 

Es importante recordar que estos datos de validación deben incluirse siempre en los resultados de vuestro experimento junto con las referencias en las que se indique donde se ha utilizado el anticuerpo real descrito.

 

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