Para poner en contexto la necesidad de generar una curva patrón o curva estándar, conviene recordar que la técnica ELISA es un inmunoensayo que se realiza con el fin de determinar la presencia y/o concentración de una determinada proteína en una muestra de naturaleza líquida.

Cuando se lleva a cabo un inmunoensayo ELISA, pueden obtenerse tres tipos de resultados:

  • Resultados cualitativos 

Mediante el inmunoensayo ELISA podemos determinar si la proteína diana se encuentra presente en la muestra problema, comparándola con un control negativo.

  • Resultados semicuantitativos 

Con el objetivo de determinar la cantidad relativa de proteína diana entre distintas muestras, estas pueden compararse teniendo en cuenta que la concentración de proteína diana en las mismas será proporcional a la intensidad de la señal que generen.

  • Resultados cuantitativos   

La preparación de la curva patrón en este caso, es un paso crítico para la obtención de datos cuantitativos precisos.

Este método se fundamenta en la proporcionalidad que existe entre los valores de absorbancia de una determinada muestra y la concentración de proteína diana presente en la misma.

Mediante los ensayos ELISA también se puede determinar con precisión la concentración de proteína diana en una determinada muestra. Para ello es preciso preparar previamente una curva patrón o curva estándar con concentraciones conocidas de la proteína diana, utilizando para ello diluciones preparadas a partir del antígeno purificado.

En esta entrada resumimos los pasos a seguir para la correcta realización de una curva patrón o curva estándar para llevar a cabo un inmunoensayo ELISA cuantitativo.

 

Cómo hacer una curva patrón para ELISA

La curva patrón debe prepararse cada vez que se lleve a cabo un experimento, y para cada placa de manera independiente, ya que existen factores como la temperatura, el tiempo de incubación, el pipeteado, etc. que pueden afectar directamente a los resultados.

 1.- Elegir el estándar

La curva patrón se construye a partir de una serie de muestras con una cantidad conocida de antígeno descendente, para lo que se suele partir de antígeno purificado.

Los kits ELISA comerciales suelen incluir este estándar como un componente más del propio kit.

En otros casos, puede adquirirse la proteína purificada o purificarla en su forma recombinante en el laboratorio.

 

2.- Seleccionar el rango de la curva patrón

Las cantidades de proteína que suelen detectarse mediante ELISA dependen de cada reacción antígeno-anticuerpo, aunque con frecuencia suelen ser inferiores a 0,1ng.

Normalmente suelen construirse curvas en el rango de 0 a 1000pg/mL, aunque este puede ampliarse en el caso de que se esté trabajando con muestras concentradas.

 

3.- Diluciones seriadas

Para la preparación de la curva patrón o curva estándar, es necesario realizar diluciones seriadas a partir del antígeno que se empleará como estándar. El rango de concentraciones que se prepare deberá ser próximo a la concentración esperada de la muestra problema.

Las diluciones se ensayan por duplicado o triplicado, y tras leer la absorbancia de cada uno de los pocillos, se calcula la media de las mismas para cada dilución. Estos valores de absorbancia se representarán en una gráfica (eje Y) frente a las concentraciones conocidas de antígeno obtenidas a partir de las diluciones seriadas (eje X).

Una vez obtenida la curva patrón, la concentración de la muestra problema se calcula extrapolando su absorbancia en dicha gráfica. Muchos lectores de placas ELISA incorporan programas que generan automáticamente la curva patrón, aunque también es habitual recurrir a programas como excel o similares.

Por último, si se diera el caso de que la muestra tenga un valor de absorbancia que cae fuera del rango de la curva estándar, esta deberá diluirse antes de su lectura. La concentración obtenida a partir de la curva patrón en estos casos, deberá después multiplicarse por el factor de dilución correspondiente.

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