Desarrollar tu propio ELISA tipo sandwich puede no resultar una tarea sencilla, ya que son varios los factores que influyen en el correcto funcionamiento del inmunoensayo, como los anticuerpos, los buffers, los diluyentes e incluso las propias placas, entre otros.

Para poner a punto un ELISA tipo sandwich, es necesario el desarrollo del inmunoensayo reuniendo todos los reactivos necesarios y definiendo los protocolos de trabajo, así como una posterior fase de optimización mediante el ensayo en distintas condiciones, concentraciones y variables hasta asegurar que los resultados serán robustos y precisos.

Cómo desarrollar un ELISA tipo sandwich

Factores a considerar a la hora de desarrollar un ELISA tipo sandwich

Los diferentes formatos de inmunoensayos ELISA ofrecen distintos niveles de especificidad, sensibilidad, complejidad y consumo de tiempo, en función de los pasos que impliquen.

El ELISA tipo sandwich se considera el formato más robusto de todos, debido a que el antígeno es detectado por dos anticuerpos diferentes. Y precisamente por esta peculiaridad, requiere un par de anticuerpos específicos que sean compatibles este sí. (Recuerda la entrada Claves para seleccionar pares de anticuerpos)

Materiales y reactivos necesarios para poner a punto un ELISA tipo sandwich

Los principales materiales y reactivos que se requieren para la puesta a punto de un ELISA tipo sandwich son los siguientes:

  • Placas de micropocillos
  • Recipientes desechables para los reactivos
  • Dispositivo de lavado (lavador de microplacas o botellas de lavado manual)
  • Pipetas de diversos volúmenes
  • Pipetas multicanal (8-12)
  • Puntas de pipeta
  • Lector de microplacas
  • Buffer de lavado
  • Diluyentes
  • Sistema de detección (p.e. estreptavidina-HRP
  • Pareja de anticuerpos validada
  • Solución stop

Pasos para desarrollar un ELISA tipo sandwich

El primer paso consiste en preparar la placa, tapizándola con el anticuerpo de captura. Para ello, se realizan los siguientes pasos de manera secuencial:

  • Transferir el anticuerpo de captura diluido en PBS a los micropocillos de la placa, sellarla e incubarla a temperatura ambiente.
  • Lavar al menos 3 veces utilizando el buffer de lavado.
  • Bloquear la placa añadiendo un buffer de bloqueo (Recuerda la entrada Tips para elegir el buffer de bloqueo), e incubando a temperatura ambiente durante al menos una hora.
  • Lavar de nuevo.

Una vez tapizada la placa con el anticuerpo de captura, comienza el procedimiento del ensayo:

  • Se añade la muestra a los pocillos correspondientes y se incuba la placa a temperatura ambiente durante dos horas.
  • Lavar al menos 3 veces utilizando el buffer de lavado.
  • Añadir el anticuerpo de detección biotinilado, y volver a incubar durante dos horas a temperatura ambiente.
  • Lavar al menos 3 veces utilizando el buffer de lavado.
  • Añadir Estreptavidina-HRP e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  • Lavar al menos 3 veces utilizando el buffer de lavado.
  • Añadir la solución con el sustrato e incubar otros 20 minutos a temperatura ambiente.
  • Añadir la solución stop.
  • Proceder a la lectura de los resultados, determinando la densidad óptica (OD) de cada pocillo durante los siguientes 30 minutos.

Cómo optimizar el rendimiento de un ELISA tipo sandwich

Una vez desarrollado un ELISA tipo sandwich que funciona, es necesario llevar a cabo algunos procedimientos de optimización que permitan mejorar su rendimiento.

Estos procedimientos irán principalmente encaminados a ensayar diferentes concentraciones de anticuerpos, muestra y buffers, hasta dar con la combinación que ofrezca los mejores resultados.

1.- Optimizar la concentración de los anticuerpos de captura y detección y el conjugado enzimático:

Se prepararán distintas concentraciones de los anticuerpos (diluidos en el buffer de tapizado (anticuerpo de captura) y en el diluyente estándar (anticuerpo de detección)) y el conjugado enzimático, y se aplicará el mismo volumen de cada concentración a los pocillos correspondientes, buscando aquella con la que se obtenga una señal más intensa al mismo tiempo que un bajo ruido de fondo.

2.- Optimizar el buffer de bloqueo:

Se prepararán diferentes soluciones de bloqueo y se aplicará el mismo volumen de cada una de ellas a los pocillos correspondientes, buscando aquella con la que se obtenga una señal más intensa al mismo tiempo que un bajo ruido de fondo.

3.- Optimizar la concentración de la muestra:

La composición del diluyente estándar debería ser lo más parecida posible a la matriz de la muestra que se vaya a analizar. Si dicha matriz no puede ser reproducida, se ensayarán distintas soluciones de dilución estándar. Se aplicará el mismo volumen de cada una de ellas a los pocillos correspondientes, buscando en este caso aquella con la que se obtenga un buen rango dinámico para la curva estándar.

4.- Optimizar la temperatura y los tiempos de incubación:

Pueden incrementarse los tiempos de incubación a temperatura ambiente, o sustituirse por incubaciones a 4º o 37ºC con el fin de conseguir una mayor sensibilidad, aunque sin perder de vista que esto también podría resultar en un incremento de la señal de fondo.

Para finalizar, os recordamos la entrada 6 Tips para solucionar problemas en un inmunoensayo ELISA donde podéis ampliar la información para optimizar vuestro ELISA tipo sándwich.

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