La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado el mundo de la ingeniería genética gracias a su capacidad para solventar las limitaciones que presentan otras técnicas de última generación recientemente desarrolladas. Esta novedosa herramienta de edición genómica, mejora significativamente la eficiencia en cuanto a que permite escalar los procesos con un reducido coste, permite introducir o eliminar más de un gen al mismo tiempo y no es especie-específico, lo que posibilita su uso en prácticamente cualquier organismo.

La tecnología CRISPR/Cas9 tiene su origen en un sistema de respuesta inmune adaptada de organismos procariotas, que se basa en utilizar RNA no codificante como guía de la nucleasa Cas9 para inducir escisiones sobre puntos específicos del DNA.

Esta herramienta de edición genómica consiste en dos componentes clave:

1.- Una endonucleasa no específica (Cas9)

2.- Una secuencia corta de RNA (gRNA) que actúa como guía para que la endonucleasa se una a una secuencia específica del genoma donde ejercerá su acción.

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Imagen: Origene

Aplicaciones de la tecnología CRISPR/Cas9

Aunque en un principio la tecnología CRISPR/Cas fue diseñada para la generación de organismos knock-out, la versatilidad y las posibilidades de modificar la enzima Cas9 han ampliado considerablemente el abanico de aplicaciones de esta herramienta, entre las que podemos destacas las siguientes:

  • Generación de Knock-outs

La diana genómica puede ser cualquier secuencia de DNA de aproximadamente 20 nucleótidos, siempre que dicha secuencia sea única en comparación con el resto del genoma, y que la diana se encuentre inmediatamente después de un motivo PAM (Protospacer Adjacent Motif).

  • Activar o inhibir genes diana de forma selectiva

Una de las características que permite la flexibilidad del sistema CRISPR/Cas9, es que la capacidad de la enzima Cas9 para unirse al ADN diana es independiente a su capacidad para cortarlo. Ambos dominios de la nucleasa (RuvC- y HNH-) pueden inactivarse mediante mutaciones específicas, dando lugar a la nucleasa dCas9, sin actividad para cortar el ADN pero manteniendo su capacidad de unión al DNA diana en función de la secuencia del gRNA. Esta inactivación en sí misma puede ser suficiente para inhibir la transcripción bloqueando su inicio. Adicionalmente, la enzima dCAs9 puede acoplarse a inhibidores o activadores específicos a fin de obtener resultados más robustos.

  • Purificar regiones específicas de DNA

Partiendo del concepto de la técnica ChIP (Inmunoprecipitación de la cromatina), se ha desarrollado enChIP (Inmunoprecipitación de cromatina mediada por molécula de unión a DNA), que permite la purificación de cualquier secuencia genómica especificada por un determinado gRNA.

  • Visualización de DNA en células vivas mediante microscopía de fluorescencia

Fusionando una dCas9 a un marcador fluorescente como GFP, la enzima puede transformarse en una etiqueta personalizable que permita detectar una secuencia específica de DNA en células vivas.

¿Cómo planificar un experimento con tecnología CRISPR/Cas9?

1º.- Seleccionar la manipulación genética de interés

Los diferentes tipos de manipulación genética requieren distintos componentes CRISPR. A continuación os dejamos una tabla con los componentes en función de la aplicación de interés:

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2º.- Seleccionar el sistema de expresión

Para utilizar un sistema CRISPR/Cas9, ambos componentes (gRNA y Cas9) deberán expresarse en las células diana. El sistema de expresión dependerá de la aplicación específica.

3º.- Seleccionar la secuencia diana y diseñar el gRNA

Los pasos a seguir son:

  • Elegir la especie y línea celular. La secuencia genómica que se utilice para el diseño del gRNA dependerá del gen de interés así como de la especie a la que pertenezcan las células.
  • Seleccionar el gen y la región diana. Es necesario identificar la secuencia genómica del gen diana, aunque la región exacta de dicho gen dependerá de la aplicación específica:
    • Activar/inhibir genes: El gRNA deberá ir dirigido al promotor de expresión.
    • Knock-outs: El gRNA se dirige a los exones
    • Edición genómica: El gRNA se dirigirá a una secuencia próxima a la zona que se pretende editar.
  • Seleccionar los gRNA: Para que el gRNA se una al DNA es absolutamente necesaria la existencia de una secuencia PAM, por lo que será necesario identificar previamente todas las secuencias PAM dentro de la región diana. También es necesario analizar el resto del genoma en busca de posibles homologías de la secuencia diana para evitar uniones inespecíficas.
  • Sintetizar y clonar los gRNA.
  • Entrega de gRNA y Cas9. El método de entrega dependerá del sistema de expresión que se haya seleccionado.
  • Validación de la edición del genoma. El método para la validación dependerá de la aplicación específica, aunque existen algunas vías de verificación generales basadas principalmente en PCR, electroforesis y secuenciación.

La tecnología CRISPR/Cas9 ha supuesto una auténtica revolución en el ámbito de la edición genómica, proporcionando un método flexible, sencillo, altamente específico y de reducido coste, que democratiza el uso de la ingeniería genética en distintos sectores.

Si estás pensando en incorporar esta tecnología a tu línea de investigación, existen kits específicos con todos los componentes necesarios para que la aplicación de la tecnología CRISPR/Cas y protocolos detallados para su correcta utilización.

No dudes en contactar con nosotros para resolver cualquier duda respecto a esta novedosa técnica.

 

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