En ocasiones, algunos detalles a los que no se les presta demasiada atención pueden impactar de manera considerable en la precisión y la reproducibilidad de los resultados de una determinada técnica.

En esta entrada repasamos los aspectos más críticos en cada uno de los pasos que componen esta técnica para saber cómo mejorar la precisión del Western Blot.

 

Cómo mejorar la precisión del Western Blot: 5 pasos

 

1.- Preparación de la muestra

El primer paso para conseguir un Western Blot limpio y preciso radica en la correcta preparación de la muestra objeto de análisis.

La elección del método de extracción de la proteína resulta crítica en este paso. Así mismo, es importante prestar especial atención a aspectos como:

  • Buffers
  • Procedimientos de homogeneización
  • Procedimientos de fraccionamiento
  • Inhibidores de proteasas,
  • Temperatura
  • Almacenamiento de muestras

Te dejamos más información en esta entrada sobre Preparación de muestras para Western Blot.

 

2.- Electroforesis en gel

El SDS-PAGE es el método más utilizado para separar las proteínas en función de su peso molecular. Las proteínas de mayor tamaño migran más lentamente a través del gel, mientras que las de pequeño tamaño lo hacen a mayor velocidad, dando como resultado una separación en función de su tamaño.

Para que esta separación sea lo más clara posible, tanto la concentración del gel como las condiciones del ensayo deben optimizarse para cada caso concreto.

En esta entrada puedes encontrar más información sobre Cómo hacer un SDS-PAGE: trucos y consejos.

 

3.- Transferencia de la proteína

La transferencia a una membrana de las proteínas previamente separadas mediante electroforesis, permite un mejor manejo y una mayor accesibilidad para los anticuerpos y demás reactivos de detección.

En este punto, es importante seleccionar adecuadamente el tipo de transferencia por el que se va a optar:

  • Transferencia húmeda
  • Transferencia semiseca
  • Transferencia seca

Todas ellas se basan en la movilidad electroforética de las proteínas para migrar del gel a la membrana, y las principales diferencias entre ellas residen en el tipo de equipamiento necesario en cada caso, así como en la velocidad y eficiencia de la transferencia.

En esta entrada encontrarás 7 tips para transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot para ampliar la información.

 

4.- Bloqueo de la membrana

El paso de bloqueo previene las uniones no específicas del anticuerpo a la membrana saturando la misma con proteínas no reactivas, por lo que la correcta selección y optimización de los buffers de bloqueo es otro de los puntos críticos para conocer cómo mejorar la precisión del Western Blot.

Para una adecuada elección del buffer de bloqueo, hay que tener en cuenta el sistema de detección que se va a emplear, así como al antígeno que se pretende detectar.

Te contamos más en estos Tips para elegir el buffer de bloqueo.

 

5.- Detección

De cara a la detección de la proteína de interés, es de vital importancia la utilización de la concentración adecuada de anticuerpos para cada ensayo. Una concentración no óptima podría resultar en problemas como:

  • Señal débil
  • Bandas no específicas
  • Ruido de fondo

La determinación de la concentración óptima de anticuerpos en cada caso, depende de varios factores, entre ellos:

  • La concentración de antígeno
  • La especificidad del anticuerpo
  • La afinidad de los anticuerpos
  • Condiciones experimentales (composición de buffers, lavados, etc.)

Para profundizar a este respecto, te dejamos esta entradas sobre Cómo elegir los anticuerpos para western blot y también esta otra con consejos para Optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo para western blot.

 

NEWSLETTER ¡No olvides suscribirte a nuestra newsletter aquí para recibir las actualizaciones semanales de este blog de investigación y anticuerpos!

Uso de cookies

Este sitio web utiliza cookies para que usted tenga la mejor experiencia de usuario. Si continúa navegando está dando su consentimiento para la aceptación de las mencionadas cookies y la aceptación de nuestra política de cookies, pinche el enlace para mayor información.plugin cookies

ACEPTAR
Aviso de cookies

Pin It on Pinterest

Share This