El Western Blot es una técnica de uso común en los laboratorios de investigación científica. Mediante esta técnica, las distintas proteínas presentes en una muestra se separan en función de su peso molecular mediante electroforesis en gel, y posteriormente se transfieren a una membrana para proceder a su identificación utilizando anticuerpos específicos.
Aunque el fundamento de la técnica se mantiene, a lo largo de los años se han ido desarrollando nuevos métodos de detección con el fin de obtener resultados más precisos y que permitan además un análisis cuantitativo de las proteínas.
En esta entrada os traemos un resumen de los principales métodos de detección para Western Blot con las ventajas e inconvenientes de cada uno de ellos.
Métodos de detección para Western Blot
1.- Métodos de detección radiactiva
Este tipo de detección fue uno de los primeros métodos utilizados para revelar los resultados del Western Blot, mediante el marcaje de los anticuerpos con conjugados radiactivos.
La principal ventaja que presenta este método radica en su sensibilidad, pero tiene el gran inconveniente de que al utilizar materiales radiactivos existe riesgo de seguridad y para la salud del investigador. Además, es una técnica de elevado coste y su ejecución requiere mucho tiempo.
En la actualidad la detección radiactiva no se encuentra entre los métodos de detección para Western Blot de elección. De hecho, se desaconseja su uso.
2.- Métodos de detección enzimática
Estos métodos se basan en el uso de anticuerpos secundarios conjugados a una enzima que cataliza una reacción con un sustrato específico.
Dentro de esta categoría la detección puede realizarse mediante dos tipos de reacciones enzimáticas:
2.1 Detección colorimétrica
En este caso, la enzima unida al anticuerpo secundario desencadena una reacción con el sustrato dando lugar a un precipitado coloreado que puede identificarse de manera visual.
Las ventajas de este método radican en su rapidez, sencillez y bajo coste económico, además de no requerir ningún equipamiento especial. Como inconveniente destaca su baja sensibilidad (del orden de picogramos).
Este método se suele utilizar cuando se precisa analizar de forma rápida y sencilla la presencia o ausencia de una determinada proteína.
2.2 Detección por quimioluminiscencia
En los ensayos de quimioluminiscencia, la enzima unida al anticuerpo secundario desencadena una reacción con un sustrato luminiscente generando luz.
En este caso, la gran ventaja es la alta sensibilidad que proporciona este método (del orden de femtogramos), lo que permite identificar proteínas con niveles de expresión muy bajos. Como inconveniente, destacar que requiere el uso de equipamiento especializado para la lectura de los resultados.
3.- Métodos de detección fluorescente
Este tipo de detección se basa en el uso de anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos que producen señal por ellos mismos, sin la necesidad de añadir ningún sustrato adicional.
Entre las ventajas, destacar que la señal es más estable que la producida por los métodos de detección enzimática y, sobre todo, que la posibilidad de utilizar anticuerpos marcados con fluoróforos con longitudes de onda de emisión diferentes en una misma membrana de Western Blot permite multiplexar los experimentos. También cabe destacar que este método permite además cuantificar la proteína presente en la muestra.
Como inconvenientes, una menor sensibilidad que la detección por quimioluminiscencia, y la necesidad de utilizar equipamiento especializado.
La fluorescencia está entre los métodos de detección para Western Blot más utilizados en la actualidad.
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