Cualquier inmunoensayo en el que se utilicen anticuerpos para la detección de la señal, desde un Western Blot o un ELISA hasta un ensayo de inmunohistoquímica, precisará el marcaje de dichos anticuerpos con una enzima, tinciones fluorescentes o partículas coloreadas, entre otros.

Los anticuerpos marcados pueden ser primarios o secundarios en función de que el inmunoensayo sea directo o indirecto. Aunque actualmente existe una gran variedad de anticuerpos marcados comercialmente disponibles, en ocasiones resulta necesario marcarlos directamente en el laboratorio.

En esta entrada os traemos una recopilación de los principales métodos de marcaje de anticuerpos.

 

Consideraciones generales para el marcaje de anticuerpos

Los anticuerpos contienen gran cantidad de grupos amina reactivos que permiten marcarlos covalentemente con moléculas que contengan grupos químicos capaces de reaccionar con ellas.

Sea cual sea el método utilizado, hay algunas consideraciones generales a tener en cuenta:

  • La mayoría de los métodos de marcaje de anticuerposse basan en la reacción con los residuos de lisina de las inmunoglobulinas. Por lo tanto, es importante evitar buffers y otros aditivos que contengan aminas primarias, ya que competirían por unirse al colorante con el propio anticuerpo.
  • Para llevar a cabo una reacción de marcaje de anticuerpos, es importante asegurarse de que estos tengan una pureza mayor al 90% y una concentración de al menos 0,5 mg/ml.

 

Métodos para el marcaje de anticuerpos

Ahora sí, aquí tenéis los 5 métodos de marcaje de anticuerpos que con más frecuencia se utilizan en el laboratorio de investigación:

1.- Método del Éster NHS

Este método se utiliza para el marcaje de anticuerpos con distintos fluorocromos, y no es necesario realizar ninguna modificación previa sobre el anticuerpo en cuestión.

La unión del marcaje mediante conjugación química entre el éster NHS y un grupo amina del anticuerpo se da en condiciones fisiológicas o alcalinas (pH 7,2-8) para conseguir uniones amida estables.

El principal inconveniente de este método es que los ésteres son sensibles relativamente inestables debido a su sensibilidad a la humedad. Es por ello que los anticuerpos marcados mediante este método deben utilizarse inmediatamente después de su preparación.

 

2.- Método del Isotiocianato

Igual que en el anterior, este método se utiliza para el marcaje de anticuerpos con fluorocromos. En este caso, la reacción ha de llevarse a cabo a un pH igual o superior a 9,8, lo que puede llegar a degradar determinados anticuerpos.

El isotiocianato es más estable que el NHS, pero el procedimiento es más complejo, y el rendimiento de la reacción suele ser menor en este caso.

 

3.- Método Carbodiimida

Este método se utiliza para marcar los anticuerpos con partículas carboxiladas.

Los compuestos derivados de la carbodiimida convierten los grupos carboxilo en reactivos intermedios capaces de reaccionar con las aminas. La alta reactividad de las carbodiimidas permite el marcaje de anticuerpos con materiales relativamente inertes como partículas magnéticas, partículas de oro o látex.

Este método es sencillo, pero al igual que el NHS estas moléculas son higroscópicas, por lo que el anticuerpo deberá usarse inmediatamente después de su marcaje.

 

4.- Método de los dos tags

Con este método los anticuerpos se marcan con una molécula de naturaleza proteica como por ejemplo una enzima catalizadora (HRP, Fosfatasa alcalina,…). Como ambas moléculas tienen numerosos grupos amino, una reacción directa entre ellas resultaría además en polímeros de cada una de ellas. Por ello es necesario realizar el enlace en dos pasos separados, uniendo cada uno de estos ligandos a un tag diferente, y haciendo posteriormente que estos dos tags reaccionen entre sí.

Aunque este método requiere mucho más tiempo y trabajo que el NHS, los anticuerpos marcados resultantes son mucho más estables.

 

5.- Método del peryodato sódico

Se utiliza para generar conjugados anticuerpo-HRP. El peryodato activa la HRP mediante la creación de grupos aldheído que interaccionan con los residuos de lisina.

Hay que tener en cuenta que la unión entre la HRP y el anticuerpo es reversible a menos que se estabilice mediante la adición de cianoborohidruro sódico.

 

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