El antisuero de un animal inmunizado o el sobrenadante de un cultivo de hibridomas podrían llegar a utilizarse directamente como reactivo en determinados casos, aunque habitualmente es necesario aplicar previamente alguno de los métodos de purificación de anticuerpos para la realización y el correcto desarrollo de la mayoría de inmunoensayos.
Las inmunoglobulinas suponen aproximadamente el 20% del total de proteínas plasmáticas, por lo que no aplicar métodos específicos de purificación de anticuerpos podría resultar en reacciones no deseadas entre otros componentes del plasma/medio y la muestra diana.
Existen diversos métodos de purificación de anticuerpos, dependiendo del material de partida, el grado de pureza que se desee obtener y la aplicación o el uso que se prevea hacer de ese anticuerpo. Todos ellos tratan de aislar selectivamente los anticuerpos de interés a partir de suero inmune (purificación de anticuerpos policlonales) o bien a partir de líquido ascítico o sobrenadante de cultivo (purificación de anticuerpos monoclonales).
Clasificación de los métodos de purificación de anticuerpos
Los métodos de purificación de anticuerpos pueden dividirse en dos grandes grupos: separación por fraccionamiento y purificación por afinidad. A continuación te detallamos en qué consiste cada uno de ellos, así como los distintos tipos de purificación que engloban.
1. FRACCIONAMIENTO: consiste en la purificación del anticuerpo por separación en base a características físico-químicas. Aísla un subconjunto de proteínas (incluidas las inmunoglobulinas) a partir de la muestra.
Existen cuatro tipos principales de separación por fraccionamiento.
- Purificación de anticuerpos por precipitación con sulfato amónico
Es uno de los métodos de purificación de anticuerpos más frecuentes. Al incrementar la concentración salina, determinadas proteínas se vuelven menos solubles, hasta que acaban precipitando. Los anticuerpos precipitan a menores concentraciones de sulfáto amónico que otras proteínas, debido a la alta hidrofobicidad propia de las inmunoglobulinas.
El producto resultante será la fracción Ig de la muestra (todos los anticuerpos presentes en la misma), que puede ser suficiente para determinados ensayos, o utilizarse como fase previa a una purificación por afinidad.
- Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Se utilizan resinas cargadas positiva o negativamente para unir proteínas en función de sus cargas netas en un determinado buffer (a un determinado pH).
- Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
Permite separar anticuerpos (˃140kDa) de componentes con un menor pero molecular (MW) presentes en la muestra, como pequeñas proteínas y péptidos.
Habitualmente se utiliza como paso previo a una purificación por afinidad, y no como un método de purificación de anticuerpos definitivo en sí mismo.
- Cromatografía de quelatos metálicos (IMAC)
Utiliza quelatos de iones metálicos divalentes inmovilizados para unirse a proteínas o péptidos que contengas clusters de histidina (por ejemplo, las IgG de mamíferos) o más de tres residuos de histidina consecutivos. (También es un método de purificación habitual para proteínas recombinantes con cola de histidina).
2.PURIFICACIÓN POR AFINIDAD: consiste en la purificación del anticuerpo mediante la unión específica a otra molécula por la que presenta alta afinidad. Aísla las inmunoglobulinas de manera clase-específica o antígeno-específica. Veamos las diferencias:
a) Purificación clase-específica: consiste en la unión a fase sólida de una determinada clase de anticuerpos (por ejemplo las IgG), mediante ligandos inmovilizados que presentan afinidad específica frente a esa clase de inmunoglobulinas. Purifica todas las Inmunoglobulinas de una determinada clase, independientemente de su afinidad por el antígeno de interés.
La purificación se lleva a cabo mediante la unión específica del anticuerpo a una proteína de origen bacteriano:
- Proteína A: Staphylococcus aureus
- Proteína G: Streptococcus spp.
- Proteína L: Peptostreptococcus magnus
En general, las proteínas A y G se unen selectivamente a las inmunoglobulinas de clase G (IgG), mientras que la proteína L lo hace a cualquier clase de anticuerpo. A continuación te detallamos la capacidad de unión de cada una de estas proteínas:
Estas proteínas (las que se comercializan habitualmente son de origen recombinante, eliminándose así secuencias innecesarias), se inmovilizan de forma covalente sobre resinas porosas o beads magnéticos, a través de los que se hará pasar la muestra. Una vez lavado, se eluye la fracción que contendrá las inmunoglobulinas de interés.
En caso de que se quieran aislar anticuerpos de clases menos frecuentes, se recurrirá a otros métodos como por ejemplo:
- Para purificar IgM: puede realizarse una precipitación con sulfato amónico seguida de una filtración por exclusión y una cromatografía de intercambio iónico. O bien, precipitación con sulfato amónico seguida de una eliminación de las IgG mediante la purificación de anticuerpos con proteína A o G.
- Para purificar IgA: se suele recurrir al uso de lectinas vegetales como la Jacalina, que se une específicamente a esta clase de anticuerpos.
- Para purificar IgY: suele utilizarse un protocolo similar a la purificación por precipitación con sulfato amónico, introduciendo algunas variasntes.
b) Purificación antígeno-específica: Separa las inmunoglobulinas que se unen específicamente a un antígeno inmovilizado. Purifica todos los anticuerpos específicos para ese antígeno, con independencia de su clase o isotipo.
Esta vez, el antígeno de interés se inmoviliza en fase sólida, donde los anticuerpos específicos quedarán retenidos al paso de la muestra.
Muy importante en este caso optimizar la orientación del antígeno así como los puntos de unión a la superficie sólida (sobre todo para péptidos de pequeño tamaño), ya que las uniones químicas a los beads de agarosa podrían enmascarar los sitios de unión al anticuerpo.
En definitiva, los métodos de purificación de anticuerpos no son más que técnicas derivadas y especializadas de los métodos de purificación de proteínas en general. Dependiendo del grado de especificidad con el que deseemos dotar a nuestro anticuerpo, existe un amplio abanico de formas de purificación entre las que podremos optar por la que mejor se ajuste a cada ensayo.
Recuerda que puedes contactar con nosotros para cualquier duda respecto a los métodos de purificación de anticuerpos. Y si te interesa, aquí puedes conocer más sobre nuestro servicio de producción y purificación de anticuerpos a medida.
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