Para obtener un resultado fiable en Western Blot, optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo que se van a emplear en el ensayo es un paso fundamental.
No existe una concentración óptima específica que pueda aplicarse a todos los experimentos, ya que la tasa de unión antígeno-anticuerpo estará condicionada por factores como la cantidad de antígeno presente en la muestra, la especificidad de los anticuerpos, la temperatura, el pH o los componentes de los buffers.
En esta entrada repasaremos una forma sencilla de optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo para western Blot, y evitar así problemas como señales débiles o inexistentes, bandas inespecíficas o excesivo ruido de fondo, entre otros.
Optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo para Western Blot
La concentración óptima de antígeno y anticuerpo puede determinarse llevando a cabo varios Western Blots a diferentes concentraciones. Pero existe una manera mucho más fácil y rápida, y es mediante la realización de un dot blot.
¿Cuál sería el procedimiento para optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo mediante un dot blot? A continuación os resumimos los pasos a seguir:
1.- Preparar diluciones a partir de la muestra de proteína en PBS o TBS.
2.- Cortar una tira de membrana de nitrocelulosa (de aproximadamente 1cm) por cada concentración de anticuerpo primario o secundario que se quiera probar.
3.- Poner las tiras secas de membrana de nitrocelulosa sobre papel de filtro y colocar puntos de cada dilución de antígeno sobre las tiras, utilizando siempre el menor volumen posible en cada uno de ellos.
4.- Dejar secar las membranas.
5.- Bloquear los sitios no específicos de las membranas de nitrocelulosa incubándolas con el buffer de bloqueo a temperatura ambiente y con agitación.
6.- Preparar diluciones del anticuerpo primario y aplicarlo sobre las tiras de membrana.
7.- Incubar de nuevo a temperatura ambiente con agitación.
8.- Lavar las tiras de membrana con el buffer de lavado.
9.- Preparar diluciones del anticuerpo secundario y añadirlas a las tiras de membrana.
10.- Volver a incubar a temperatura ambiente con agitación.
11.- Lavar de nuevo las membranas con el buffer de lavado.
12.- Preparar la solución con el sustrato.
13.- Incubar las tiras de membrana con la solución de sustrato.
14.- Retirar las tiras de membrana y colocarlas sobre láminas de plástico o alguna otra envoltura protectora.
15.- Con la parte de la proteína hacia arriba, colocar las tiras envueltas contra la película y exponerlas durante 30-60 segundos.
16.- Un blot óptimo deberá dar como resultado una banda clara para la proteína de interés sin señal de fondo ni bandas inespecíficas.
17.- En el caso de que no se consiguieran los resultados óptimos, se deberá repetir todo el proceso probando diferentes diluciones de antígeno y anticuerpo.
Para terminar esta entrada sobre cómo optimizar la concentración de antígeno y anticuerpos para western blot, os dejamos algunas entradas relacionadas que pueden resultaros de interés:
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