Para obtener un resultado fiable en Western Blot, optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo que se van a emplear en el ensayo es un paso fundamental.

No existe una concentración óptima específica que pueda aplicarse a todos los experimentos, ya que la tasa de unión antígeno-anticuerpo estará condicionada por factores como la cantidad de antígeno presente en la muestra, la especificidad de los anticuerpos, la temperatura, el pH o los componentes de los buffers.

En esta entrada repasaremos una forma sencilla de optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo para western Blot, y evitar así problemas como señales débiles o inexistentes, bandas inespecíficas o excesivo ruido de fondo, entre otros.

 

Optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo para Western Blot

La concentración óptima de antígeno y anticuerpo puede determinarse llevando a cabo varios Western Blots a diferentes concentraciones. Pero existe una manera mucho más fácil y rápida, y es mediante la realización de un dot blot.

¿Cuál sería el procedimiento para optimizar la concentración de antígeno y anticuerpo mediante un dot blot? A continuación os resumimos los pasos a seguir:

1.- Preparar diluciones a partir de la muestra de proteína en PBS o TBS.

2.- Cortar una tira de membrana de nitrocelulosa (de aproximadamente 1cm) por cada concentración de anticuerpo primario o secundario que se quiera probar.

3.- Poner las tiras secas de membrana de nitrocelulosa sobre papel de filtro y colocar puntos de cada dilución de antígeno sobre las tiras, utilizando siempre el menor volumen posible en cada uno de ellos.

4.- Dejar secar las membranas.

5.- Bloquear los sitios no específicos de las membranas de nitrocelulosa incubándolas con el buffer de bloqueo a temperatura ambiente y con agitación.

6.- Preparar diluciones del anticuerpo primario y aplicarlo sobre las tiras de membrana.

7.- Incubar de nuevo a temperatura ambiente con agitación.

8.- Lavar las tiras de membrana con el buffer de lavado.

9.- Preparar diluciones del anticuerpo secundario y añadirlas a las tiras de membrana.

10.- Volver a incubar a temperatura ambiente con agitación.

11.- Lavar de nuevo las membranas con el buffer de lavado.

12.- Preparar la solución con el sustrato.

13.- Incubar las tiras de membrana con la solución de sustrato.

14.- Retirar las tiras de membrana y colocarlas sobre láminas de plástico o alguna otra envoltura protectora.

15.- Con la parte de la proteína hacia arriba, colocar las tiras envueltas contra la película y exponerlas durante 30-60 segundos.

16.- Un blot óptimo deberá dar como resultado una banda clara para la proteína de interés sin señal de fondo ni bandas inespecíficas.

17.- En el caso de que no se consiguieran los resultados óptimos, se deberá repetir todo el proceso probando diferentes diluciones de antígeno y anticuerpo.

 

Para terminar esta entrada sobre cómo optimizar la concentración de antígeno y anticuerpos para western blot, os dejamos algunas entradas relacionadas que pueden resultaros de interés:

 

Síguenos en

Uso de cookies

Este sitio web utiliza cookies para que usted tenga la mejor experiencia de usuario. Si continúa navegando está dando su consentimiento para la aceptación de las mencionadas cookies y la aceptación de nuestra política de cookies, pinche el enlace para mayor información.plugin cookies

ACEPTAR
Aviso de cookies

Pin It on Pinterest

Share This