Los plásmidos para la sobre-expresión de proteínas, tanto en su modalidad de clones de cDNA como clones ORF, se han convertido en una herramienta indispensable en el ámbito de la investigación biomédica, tanto para analizar la estructura de los genes y entender así su función, como para el estudio de la actividad biológica y dinámica de las proteínas que codifican.
El proceso de clonaje y posterior secuenciación de los genes puede evitarse recurriendo a los plásmidos comerciales listos para su uso y con secuencias verificadas, mediante herramientas de búsqueda sencillas.
Diferencias entre clones de cDNA y clones ORF
La diferencia fundamental reside en que los clones ORF (Open Reading Frame) contienen únicamente la secuencia codificante de la proteína de interés, mientras que los clones de cDNA, además de la secuencia codificante, incluyen secuencias no traducidas de los extremos 5’ o 3’ (UTRs) o intrones.
Analicemos cada uno de ellos con más detalle:
1.- Clones de cDNA
Los clones de cDNA pueden obtenerse mediante dos vías diferentes: a partir de material biológico o mediante producción sintética. En el primer caso, el proceso es bastante laborioso y consume muchos recursos tanto económicos como de tiempo. Sin embargo, la producción sintética de clones de cDNA es un proceso que se lleva a cabo en tres pasos bien definidos: síntesis, clonación y validación.
Como ya hemos comentado, los clones de cDNA incluyen la secuencia codificante de la proteína, así como las regiones no traducidas de los extremos 3’ (3’UTR) y 5’ (5’UTR), y pueden encontrarse plásmidos comerciales para diversas especies como humano, ratón, rata, bovino o pez cebra, entre otros.
2.- Clones ORF
Los clones ORF ofrecen una simplificación a la hora de expresar una proteína, facilitando multitud de aplicaciones como la detección y/o purificación de la proteína, la localización intracelular, etc.
Estos clones ORF pueden presentarse en distintos vectores dependiendo del sistema de expresión que se vaya a utilizar para la obtención de la proteína: bacterias, levaduras, células de mamífero, insecto, sistemas libres de células, etc.
Así mismo, pueden incluir distintos tags en función de la aplicación y las ventajas que se busquen. Entre los más habituales podemos destacar:
- His6 y FLAG: estos tags facilitan la purificación de la proteína mediante el uso de anticuerpos anti-His6 o anti-FLAG. Además, debido a su pequeño tamaño, la probabilidad de que interfieran con la función de la proteína es mínima.
- GFP: Al tratarse de un tag fluorescente, además de facilitar la purificación de la proteína mediante anticuerpos anti-GFP, permite otras aplicaciones como el marcaje de células vivas.
En determinados casos también se puede optar por el uso de clones ORF sin tag, por ejemplo, cuando el tag pueda interferir con el plegado, la localización o la actividad de la proteína, o bien, cuando dispongamos de un anticuerpo específico para la localización y purificación de la proteína.
Llegados a este punto, podría surgir la siguiente pregunta: ¿Cuál de los dos tipos de plásmidos debería elegir para llevar a cabo mi proyecto? Pues como casi siempre, depende. Depende del objetivo de cada experimento. Por ejemplo, si simplemente buscamos sobre-expresar la proteína bajo condiciones transitorias, sería suficiente con utilizar un clon de cDNA. Sin embargo, en el caso de que no contemos con un buen anticuerpo frente a la proteína de interés, que necesitemos un método sencillo para purificarla, o debamos crear una línea celular estable para la sobre-expresión de la misma, nos decantaríamos por un clon ORF.
Para terminar, os dejamos nuestra selección de las casas que ofrecen mejores clones de cDNA y clones ORF:
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