Esta semana, siguiendo vuestras sugerencias tanto a través de la encuesta de twitter, así como las que nos habéis hecho llegar directamente por correo electrónico, os traemos una entrada con una recopilación de preguntas frecuentes sobre anticuerpos (antibody FAQ).

Las hemos distribuido en cinco grandes bloques:

1.- Antígenos

2.- Anticuerpos a medida

3.- Purificación

4.- Aplicaciones y uso

5.- Almacenamiento

Preguntas frecuentes sobre anticuerpos

1.- ANTÍGENOS

P: ¿Es importante conocer la aplicación final del anticuerpo para seleccionar el antígeno óptimo?

R: Sí, es fundamental conocer el ensayo en el que se utilizará el anticuerpo. No todos los anticuerpos funcionan en todas las aplicaciones. Mientras que en un Western Blot el anticuerpo reconocerá una proteína desnaturalizada, en inmunoensayos ELISA, Inmunofluorescencia (IF) y en otros ensayos funcionales, el anticuerpo deberá reconocer la forma natural y plegada de la proteína.

P: ¿Qué tipo de antígenos pueden utilizarse para la producción de anticuerpos?

R: Pueden utilizarse como antígeno para la inmunización los péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, proteínas nativas, células completas, DNA, pequeñas moléculas no proteicas o anticuerpos (para la obtención de anticuerpos anti-idiotipo).

Si quieres conocer más acerca de las claves para seleccionar un buen antígeno, puedes encontrar más información aquí.

2.- ANTICUERPOS A MEDIDA

P: ¿Debería utilizar un anticuerpo monoclonal o uno policlonal?

R: Esta elección depende de múltiples factores, ya que tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales presentan ventajas e inconvenientes.

Los anticuerpos policlonales son más económicos y se obtienen en un plazo de tiempo menor, pero la reproducibilidad entre lotes es más baja, así como su especificidad, ya que reconocen distintos epítopos de un mismo antígeno. Esto último, puede suponer un inconveniente ya que podría dar lugar a reactividad cruzada, o por el contrario, puede resultar beneficioso si se pretende utilizar el anticuerpo en técnicas como la inmunoprecipitación (IP).

Los anticuerpos monoclonales son más caros y difíciles de obtener, pero la reproducibilidad entre lotes es mucho mayor y los anticuerpos son altamente específicos.

Te ampliamos la información sobre los criterios para optar por un anticuerpo monoclonal o uno policlonal aquí.

P: ¿Por qué algunos antígenos solo inducen respuesta de anticuerpos IgM?

R: Las respuestas frente a proteínas de mamíferos altamente conservadas suelen ser generalmente débiles, y resultan principalmente en anticuerpos IgM. Una manera de salvar esto podría ser la inmunización de especies con mayor distancia evolutiva como, por ejemplo, las gallinas.

3.- PURIFICACIÓN

P: ¿En qué se diferencia un anticuerpo purificado por proteína A/G de otro purificado por afinidad con el antígeno?

R: En resumen, la purificación por proteína A/G aísla todas la inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos que haya en la muestras (sean esta específicas o no frente al antígeno de interés), mientras que la purificación por afinidad con el antígeno, aísla solamente los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) específicas para dicho antígeno.

P: ¿Cuándo se recomienda la purificación por proteína A/G y cuándo la purificación por afinidad con el antígeno?

R: Aunque siempre hay que valorar cada proyecto de manera individual para poder hacer una recomendación más precisa, existen unas pautas generales. En el caso de los anticuerpos monoclonales, puesto que el material a purificar es el sobrenadante de un cultivo de hibridomas que únicamente producen un tipo de anticuerpo, sería suficiente con proceder a una purificación por proteína A/G. Sin embargo, en el caso de los anticuerpos policlonales, generalmente, el porcentaje de anticuerpo específico para nuestro antígeno suele rondar el 10% del total, por lo que en este caso estaría recomendada una purificación por afinidad con el antígeno.

Puedes encontrar más información sobre los métodos de purificación de anticuerpos en este post.

4.- APLICACIONES Y USO

P: ¿Qué diluciones de anticuerpo primario debo usar?

R: Las recomendaciones sobre la dilución óptima para cada técnica suele venir normalmente recogida en la hoja técnica de cada anticuerpo. No obstante, aquí te dejamos algunas pautas generales.

Preguntas frecuentes sobre anticuerpos diluciones-primarias

P: ¿Puedo testar el antisuero en Western Blot utilizando un antígeno peptídico como control positivo?

R: El peso molecular de un antígeno peptídico sin conjugar es demasiado bajo para aplicarlo en un Western Blot tradicional. Para validar la especificidad de la banda de interés en el Western Blot, se podría correr un control bloqueante del anticuerpo, donde el antígeno peptídico se utilice para bloquear el anticuerpo primario.

P: ¿Cómo puedo seleccionar el anticuerpo secundario adecuado?

R: La selección del anticuerpo secundario depende directamente del anticuerpo primario que se quiera detectar. Los anticuerpos secundarios deben dirigirse frente a la especie en la que hayan sido producidos los anticuerpos primarios. Es decir, si el anticuerpo primario es un monoclonal producido en ratón, el secundario debe ser un anticuerpo anti-ratón. Aquí te dejamos algunos consejos a la hora de seleccionar el anticuerpo secundario.

Para más información sobre el uso de los anticuerpos en las distintas técnicas, te recomendamos que eches un vistazo a las siguientes entradas:

ELISA: 6 tips para solucionar problemas en un inmunoensayo ELISA

WB: Cómo seleccionar controles de carga para Western Blot

IHQ: Anticuerpos para Inmunohistoquímica (IHC)

5.- ALMACENAMIENTO

P: En general, ¿cómo deben almacenarse los anticuerpos?

R: Es importante leer detenidamente las indicaciones de la hoja técnica de cada anticuerpo, ya que las condiciones óptimas pueden variar de uno a otro. No obstante, como norma general, si el anticuerpo se va a utilizar en el corto plazo, se recomienda mantenerlo refrigerado a 4ºC. Si lo que se pretende es almacenarlo por periodos superiores de tiempo, se recomienda congelarlo (en alícuotas, para evitar ciclos de congelación-descongelación) a -20ºC o -80ºC.

Puedes consultar una guía más detallada sobre cómo almacenar los anticuerpos aquí.

Esperamos que las respuestas a estas preguntas frecuentes sobre anticuerpos os hayan servido de ayuda para aclarar dudas. Si tenéis cualquier pregunta adicional, podéis dejárnosla en los comentarios e intentaremos responderla en una próxima entrada.

También, como siempre, podéis contactar con nosotros aquí.

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