El Western Blot es un inmunoensayo para la detección de proteínas en muestras complejas que se realiza siguiendo 4 pasos secuenciales:

  • SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) para separar las proteínas.
  • Transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa o polivinilpirrolidona.
  • Incubación de la membrana con un anticuerpo específico frente a la proteína de interés.
  • Detección de la unión antígeno-anticuerpo.

En esta entrada os traemos una recopilación de preguntas frecuentes sobre Western Blot que pueden ayudaros a resolver dudas y mejorar el rendimiento de vuestro inmunoensayo.

 

Preguntas frecuentes sobre Western Blot

 

1.- ¿Cuántas veces puedo utilizar las soluciones de anticuerpos una vez preparadas?

Lo recomendable es utilizar siempre soluciones de anticuerpo recién formuladas. En caso de que se reutilicen las soluciones hechas con anterioridad, es de suma importancia asegurarse de que no se ha producido sobrecrecimiento bacteriano, especialmente en los casos en los que la solución se haya bloqueado previamente con un agente de bloqueo.

 

2.- ¿Por qué aparecen bandas intensas a pesos moleculares mayores o menores de lo esperado?

En algunas ocasiones, incluso utilizando los anticuerpos a la menor dilución recomendada, este se une a proteínas cuyas bandas salen muy por debajo o muy por encima del peso molecular real de la proteína de interés. En la mayoría de estos casos dichas bandas se corresponden con isoformas de la proteína en cuestión, o bien con la formación de dímeros.

Se recomienda realizar una búsqueda para ver si están descritas en la literatura algunas isoformas o si la proteína dimeriza. También se puede probar la utilización de un anticuerpo distinto.

 

3.- En el caso de que utilice más de un anticuerpo primario, ¿en qué orden deben incubarse?

Es posible tanto la incubación simultánea con todos los anticuerpos primarios, como la incubación sucesiva con cada uno de ellos.

 

4.- ¿Es necesario medir la concentración de proteína en la muestra antes de hacer el Western Blot?

No es un paso imprescindible, aunque sí recomendable para ajustar la cantidad de muestra que se va a cargar en el gel. La determinación de la concentración de proteína total puede llevarse a cabo mediante el método BCA.

 

5.- ¿Cómo puedo separar y transferir las proteínas con tamaños mayores a 200kDa?

Puedes encontrar varios consejos para conseguir transferir proteínas de gran tamaño en esta entrada.

 

6.- ¿Cómo puedo evitar el ruido de fondo?

Esta es una de las preguntas frecuentes sobre western blot más habituales. El ruido de fondo puede deberse a causas tan dispares como una concentración de anticuerpo demasiado alta, la unión inespecífica del anticuerpo secundario, reacciones cruzadas de los anticuerpos con el agente de bloqueo o lavados insuficientes, entre otras.

Aquí te contamos como resolver estos problemas en Western Blot.

 

7.- ¿Es el Western Blot un inmunoensayo cuantitativo?

El Western Blot no es un método cuantitativo, ya que no se suele realizar una curva patrón para la proteína de interés en cada blot.

 

8.- ¿Por qué son las bandas del Western Blot de distinto tamaño al esperado?

Aunque la separación de proteínas en el Western Blot se basa en el tamaño de las mismas, existen otras variables que pueden influir en la velocidad de migración a través del gel, y hacer que la banda observada difiera de la que se pudiera predecir en base al tamaño real de la proteína.

Los factores que influyen con más frecuencia son:

  • Modificaciones postraduccionales
  • Escisiones postraduccionales
  • Isoformas y otras variantes
  • Carga relativa

 

9.- ¿Qué cantidad de muestra debo cargar en el gel?

La cantidad dependerá del tipo de muestra que manejemos:

  • Lisados celulares: la cantidad deberá optimizarse en función de los niveles de expresión de la proteína de interés en cada caso, pero de forma general podemos cargar entre 20 y 30 ug de proteína total por pocillo.
  • Proteína purificada: se suelen cargar entre 10 y 100 ng de proteína.

 

10.- ¿Por qué no consigo detectar mi proteína recombinante?

Podría deberse a que la proteína recombinante que se expresa en la muestra no incluye la secuencia antigénica que reconoce el anticuerpo que estamos empleando, o bien en el caso de que la proteína recombinante se exprese con un tag y este sea muy voluminoso o interfiera con la secuencia antigénica, podría impedir su unión al anticuerpo.

En el caso de trabajar con proteínas recombinantes, se recomienda siempre incluir un control positivo endógeno en el Western Blot.

 

11.- ¿Debo usar leche o BSA como agente de bloqueo?

En general, el BSA dará resultados más limpios ya que al contener menos proteínas, se reduce la probabilidad de reacciones cruzadas con el anticuerpo.

Sin embargo, en determinados casos, el bloqueo con leche dará mejor resultado debido precisamente a que una mayor variedad de proteínas de bloqueo tiene la capacidad de bloquear un mayor rango de proteínas distintas.

 

12.- ¿Por qué me salen tantas bandas en el Western Blot?

Esto puede deberse a varios factores, entre los que cabe destacar:

  • El anticuerpo no es lo suficientemente específico para la proteína diana.
  • Degradación del antígeno por proteólisis.
  • Demasiada cantidad de proteína por carril.
  • Sistema de detección excesivamente sensible.
  • Bloqueo ineficaz.
  • Concentración del antígeno demasiado baja.

 

13.- ¿Qué diferencia hay entre un Western Blot en condiciones reductoras y no reductoras?

Para llevar a cabo un Western Blot bajo condiciones reductoras, se añade un agente reductor como DTT o B-mercaptoetanol al buffer de la muestra para romper los puentes disulfuro, por lo que la proteína pasará a estar en su forma desnaturalizada cuando se realice el inmunoensayo.

 

14.- ¿Debo utilizar condiciones reductoras o no reductoras en mi ensayo?

Habitualmente, los Western Blot se llevan a cabo bajo condiciones desnaturalizantes. En todo caso, conviene consultar la hoja técnica de los anticuerpos para asegurarnos de que funcionarán frente a la proteína desnaturalizada.

 

Esperamos que esta entrada de Preguntas frecuentes sobre western Blot os haya resultado de interés. Por aquí os dejamos también algunas entradas relacionadas:

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