Como ocurre con otros inmunoensayos, la preparación de muestras para Western Blot (WB) resulta un paso crucial para la obtención de un resultado óptimo en nuestros experimentos.
Esta semana os traemos una breve guía que esperamos os sea de ayuda en la preparación de muestras para Western Blot, desde la extracción de la proteína hasta la preparación de la misma para la carga en el gel.
Guía para la preparación de muestras para Western Blot
1.- Selección del buffer de lisado
Los distintos buffers de lisado presentan diferencias en cuanto a su capacidad para solubilizar las proteínas. Aquellos que contienen SDS u otros detergentes iónicos son los que mayor solubilidad proporcionarán, pero en contrapartida corremos el riesgo de que la proteína se desnaturalice.
Si el anticuerpo que vamos a utilizar en el inmunoensayo no reconoce la proteína desnaturalizada, deberemos optar por un buffer con detergentes no iónicos o incluso sin ellos, aunque obtengamos un menor rendimiento.
Por otro lado, la localización de la proteína es otro de los factores determinantes a la hora de seleccionar el buffer de lisado. Por ejemplo, será imprescindible el uso de buffers con detergente en el caso de proteínas de membrana o proteínas asociadas al citoesqueleto.
2.- Preparación del lisado
A partir de cultivo celular
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- Dejar crecer las células hasta alcanzar una confluencia del 80%.
- Lavar las células en frío con PBS.
- Aspirar el PBS y añadir el buffer de lisado previamente enfriado.
- Raspar las células adheridas o digerirlas con tripsina y transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga previamente enfriado.
- Centrifugar a 4ªC teniendo en cuenta que la fuerza de centrifugación y el tiempo variarán en función del tipo celular.
- Colocar los tubos en hielo y recolectar el sobrenadante que se recogerá en nuevos tubos previamente enfriados, descartando el pellet.
A partir de tejido
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- Colocar el tejido en suero salino a 4ºC y seccionar.
- Colocar el tejido en tubos Eppendorf y criogenizar en nitrógeno líquido.
- Añadir el buffer de lisado y homogeneizar.
- Centrifugar a 4ºC teniendo en cuenta que la fuerza de centrifugación y el tiempo variarán en función del tipo de muestra.
- Colocar los tubos en hielo y recolectar el sobrenadante que se recogerá en nuevos tubos previamente enfriados, descartando el pellet.
3.- Determinación de la concentración de proteína
La concentración de la proteína puede realizarse mediante ensayo Bradford, ensayo Lowry o ensayo BCA, pudiendo usarse como estándar la albúmina de suero bovino (BSA). Una vez cuantificada la proteína, puede cargarse en el gel o congelarse y almacenarse para su posterior uso.
4.- Preparación de la muestra para carga en gel
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- Proteínas desnaturalizadas
Habitualmente, con el fin de que el anticuerpo tenga más fácil acceso al epítopo que reconoce, se suele proceder a la desnaturalización de la proteína.
Para ello, puede utilizarse un buffer de carga que contenga el detergente aniónico SDS y posteriormente hervir la mezcla a 100ºC durante 5 minutos.
En el caso de proteínas con varios dominios transmembrana, puede calentarse a 70ªC durante 10 minutos para evitar la formación de agregados que dificultarían el paso por el gel.
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- Proteínas nativas
En determinados casos, el anticuerpo no reconoce un epítopo lineal en la proteína, sino un epítopo conformacional formado por una serie de aminoácidos no contiguos que quedan cerca los unos de los otros tras el plegado tridimensional de la proteína.
En estos casos, el Western Blot deberá llevarse a cabo bajo condiciones no desnaturalizantes, lo que básicamente supone evitar el uso de SDS tanto en la muestra como en los buffers de migración, y evitar calentar las muestras.
Algunos anticuerpos, además, solamente reconocen la proteína en su forma no reducida. En estos casos será necesario evitar el uso de agentes reductores como el beta-mercaptoetanol o el DDT en los buffers de carga y migración.
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