El uso de tags de afinidad se ha convertido en una herramienta de gran utilidad a la hora de expresar proteínas de manera recombinante, facilitando en gran medida su purificación y detección, incrementando en determinadas ocasiones el rendimiento y la solubilidad e incluso favoreciendo el correcto plegamiento de la proteína en algunos casos.

Sin embargo, en ciertos casos esa cola de fusión puede interferir en la estructura y/o función de la proteína, cuando por ejemplo:

  • Altera la conformación de la proteína.
  • Interfiere con la aplicación de la proteína.
  • Dificulta la cristalización de la proteína.

En estos casos, se hace necesaria la escisión de la cola de fusión una vez purificada la proteína, y por eso hoy os traemos una guía de proteasas para la eliminación de tags de proteínas de fusión que permiten la obtención de proteínas puras libres de cola.

 

Guía de proteasas para la eliminación de tags

El uso de proteasas para la eliminación de tags implica 4 pasos básicos:

1.- Insertar el sitio de escisión específico de la proteasa seleccionada entre el tag y la secuencia de la proteína de interés. Muy importante asegurarse en este paso de que la secuencia que define el sitio de corte de la proteasa no se repite a lo largo de la secuencia de la proteína de interés, para evitar cortes secundarios no deseados.

2.- Expresar y purificar la proteína recombinante.

3.- Añadir la proteasa seleccionada.

4.- Separar la proteína pura sin el tag mediante cromatografía.

A continuación podéis encontrar un listado con las proteasas para la eliminación de tags de uso más frecuente:

 

Tev Proteasa

  • Secuencia de reconocimiento de escisión: Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly
  • Sitio de corte: antes de la Glicina
  • Peso molecular: 27kDa
  • Otras consideraciones: entre las proteasas para la eliminación de tags, esta es la de uso más común.

HRV3C Proteasa (Human Rhinovirus)

  • Secuencia de reconocimiento de escisión: Leu-Phe-Gln-Gly-Pro
  • Sitio de corte: ente la Glutamina y la Glicina
  • Peso molecular: 22kDa
  • Otras consideraciones: también puede utilizarse su variante unida a GST (PreScission protease).

Trombina

  • Secuencia de reconocimiento de escisión: Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser
  • Sitio de corte: entre la Arginina y la Glicina
  • Peso molecular: 37kDa
  • Otras consideraciones: está formada por una cadena ligera y otra pesada, unidas entre sí mediante puentes disulfuro, resultando por tanto sensible a agentes reductores.

Factor Xa

  • Secuencia de reconocimiento de escisión: Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg
  • Sitio de corte: después de la Arginina (no corta en caso de que el siguiente aminoácido sea Arginina o Prolina)
  • Peso molecular: 59kDa
  • Otras consideraciones: consta de dos cadenas unidas por puentes disulfuro, resultando sensible a agentes reductores. También se une a iones de Ca2+ por lo que no debe usarse en presencia de agentes quelantes como el EDTA.

Enterokinasa

  • Secuencia de reconocimiento de escisión: Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
  • Sitio de corte: después de la Lisina Arginina (no corta en caso de que el siguiente aminoácido sea una Prolina)
  • Peso molecular: 31kDa
  • Otras consideraciones: Su actividad es dependiente de calcio.

 

Tips para el correcto uso de proteasas para la eliminación de tags

  • No exceder la concentración de proteasa recomendada, ya que esto podría ocasionar proteólisis en sitios secundarios.
  • Optimizar la temperatura y los tiempos de incubación
  • Las proteasas dependientes de calcio no deben utilizarse con proteínas en tampón fosfato (tampón frecuentemente utilizado para la purificación de proteínas con cola de Histidina) ya que podría formarse fosfato cálcico insoluble.

 

Para terminar esta entrada sobre proteasas para la eliminación de tags, os recordamos estas entradas relacionadas que os podrían interesar:

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