La forma más estable de almacenar los péptidos durante largos periodos de tiempo, es manteniéndolos liofilizados, alejados de la luz y a bajas temperaturas. Sin embargo, cuando llega la hora de utilizarlos, la labor de reconstituir péptidos liofilizados puede suponer un quebradero de cabeza.
Conseguir la correcta disolución de los péptidos es fundamental para el adecuado desarrollo del ensayo, ya que de lo contrario pueden producirse pérdidas de péptido y/o inexactitudes a la hora de calcular la concentración de los mismos.
En esta entrada os traemos algunos consejos y directrices que pueden ayudaros a reconstituir péptidos liofilizados, y optimizar la solubilidad de los mismos.
Cómo reconstituir péptidos liofilizados
Antes de proceder a la reconstitución de péptidos liofilizados, conviene recordar algunas consideraciones generales:
- Como paso previo a la reconstitución, siempre es conveniente centrifugar los viales que contienen el péptido liofilizado para que la muestra completa quede en el pellet y no se pierda material.
- Antes de proceder a la reconstitución, el péptido debe estar a temperatura ambiente.
- Se recomienda probar la solubilidad en un determinado medio con una pequeña cantidad de péptido, hasta confirmar que se disuelve correctamente.
- El solvente de elección debe ser compatible con la aplicación experimental y no debe reaccionar ni promover la degradación del péptido.
- En términos generales, la solubilidad de un péptido vendrá determinada por la carga neta del mismo, por lo tanto:
- Los péptidos ácidos podrán resuspenderse en buffers básicos.
- Los péptidos básicos se resuspenderán en soluciones ácidas.
- Los péptidos hidrofóbicos y neutros deberán disolverse en pequeñas cantidades de algún disolvente orgánico como el DMSO, metanol, ácido acético, isopropanol, etc.
- Con el fin de mejorar la solubilidad, se puede recurrir a técnicas complementarias como la sonicación, si fuera necesario.
A la hora de proceder a la elección del disolvente óptimo para reconstituir péptidos liofilizados, hay que tener en cuenta los dos factores fundamentales que influirán en su solubilidad: La longitud del péptido y la carga neta del mismo.
1.- Longitud del péptido
Como norma general, los péptidos de menos de 5-6 aminoácidos suelen ser solubles en solución acuosa. Conviene recordar que debe utilizarse siempre agua destilada y estéril.
Para los péptidos de mayor tamaño, la solubilidad vendrá definida por su carga neta e hidrofobicidad, tal y como se detalla en el segundo punto.
2.- Carga neta del péptido
Para calcular la carga neta del péptido, se procederá de la siguiente manera, y se sumarán los valores obtenidos:
- Se asignará un valor de -1 por cada residuo ácido (Asp, Glu o -COOH C-terminal) que contenga el péptido.
- Se asignará un valor de +1 por cada residuo básico (Arg, Lys, His o -NH2 N-terminal) que contenga el péptido.
En función del valor de carga neta obtenido, actuaremos de la siguiente manera:
- Si la carga neta del péptido es negativa (péptido ácido):
- En primer lugar, se intentará reconstituir el péptido liofilizado en agua o PBS.
- Si esa primera opción falla, se añadirá NH4OH (excepto en los casos en los que el péptido contenga residuos de Cys).
- Si el péptido sigue sin disolverse, se añadirá un disolvente orgánico como DMSO hasta conseguir solubilizarlo, y posteriormente se diluirá hasta conseguir la concentración deseada.
- Si la carga neta del péptido es positiva (péptido básico):
- En primer lugar, se intentará reconstituir el péptido liofilizado en agua.
- Si esa primera opción falla, se intentará disolver el péptido en una solución de ácido acético al 25%.
- Si el péptido sigue sin disolverse, se intentará solubilizar en una pequeña cantidad de DMSO y posteriormente se diluirá hasta conseguir la concentración deseada.
- Si la carga neta del péptido es igual a 0 (péptido neutro):
- En primer lugar, se intentará reconstituir el péptido liofilizado en un disolvente orgánico.
- En los casos en que el péptido sea muy hidrofóbico, se intentará solubilizar en una pequeña cantidad de DMSO y posteriormente se diluirá con agua hasta conseguir la concentración deseada.
Aunque en muchos casos a la hora de reconstituir péptidos liofilizados estos pueden disolverse sin problema en soluciones acuosas, es importante conocer las características de los aminoácidos que los componen para poder predecir la solubilidad en cada caso. Esperamos que esta entrada os haya despejado algunas dudas al respecto.
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