El inmunoensayo ELISA se ha convertido en una de las técnicas más utilizadas a la hora de analizar y cuantificar los analitos de manera rápida en un elevado número de muestras. Entre sus ventajas cabe destacar la facilidad de uso, la posibilidad de automatización y su relativamente bajo coste.

Hoy nos centraremos en un tipo concreto de inmunoensayo ELISA, el ELISA tipo sándwich, donde el antígeno es identificado y cuantificado mediante el uso simultáneo de dos anticuerpos primarios específicos frente al mismo: un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección. En este post analizaremos las claves para seleccionar correctamente los pares de anticuerpos para la realización de este tipo de ensayos.

Fundamento del ELISA tipo sándwich

El ELISA tipo sandwich identifica y cuantifica los antígenos entre dos capas de anticuerpos (anticuerpo de captura y anticuerpo de detección), que necesariamente deberán reconocer dos epítopos diferentes de dicho antígeno a fin de no interferir entre ellos en la unión al mismo. De ahí lo crítico que resulta el paso de seleccionar correctamente los pares de anticuerpos que se utilizarán en el ensayo.

Las tres ventajas principales que presenta el inmunoensayo ELISA tipo sándwich frente a otros tipos de ELISA son las siguientes:

  • Mayor especificidad por el uso de dos anticuerpos primarios dirigidos al antígeno (el antígeno es específicamente capturado y detectado).
  • Apto para muestras complejas, ya que no requiere ningún paso previo de purificación y la muestra puede añadirse directamente sobre la placa.
  • Alta flexibilidad y sensibilidad, pudiendo utilizarse tanto con métodos de detección directa como indirecta.

Aunque, como siempre, los protocolos pueden variar y ajustarse en función de las características de cada ensayo, los pasos generales que se siguen en el desarrollo de un ELISA tipo sándwich son:

1.- Inmovilización del anticuerpo de captura sobre la placa.

2.- Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos en la superficie.

3.- Adición de la muestra con el antígeno de interés.

4.- Lavado para retirar el exceso de antígeno no unido al anticuerpo de captura.

5.- Adición del anticuerpo de detección que se unirá al antígeno inmovilizado por el anticuerpo de captura.

6.- Adición del anticuerpo secundario conjugado a una enzima (este paso es opcional, no siendo necesario si se conjuga directamente el anticuerpo de detección).

7.- Lavado para eliminar el exceso de anticuerpo.

8.- Adición de reactivo cromogénico / fluorogénico.

9.- Medición de la absorbancia / fluorescencia / señal electroquímica en los pocillos para detectar la presencia del antígeno y proceder a su cuantificación.

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Claves para seleccionar pares de anticuerpos

Como ya hemos visto, es crucial prestar especial atención a la selección de los pares de anticuerpos que utilizaremos en nuestro ensayo ELISA tipo sándwich para obtener unos resultados óptimos.

A este respecto, debemos valorar principalmente tres elementos: el antígeno utilizado para la obtención de los anticuerpos, los anticuerpos de captura y detección y el método de screening.

A.) Antígeno

A la hora de seleccionar el antígeno más apropiado para la inmunización de los animales, cabe recordar que los epítopos que reconocerán cada uno de los anticuerpos (captura y detección) no deben solaparse, y debe existir la suficiente separación espacial entre ellos en la estructura de la proteína nativa para evitar que ambos anticuerpos compitan entre sí por la unión al antígeno.

Los antígenos que se utilicen pueden ser tanto proteínas completas como péptidos de pequeño tamaño. Es habitual el uso de proteínas completas para la obtención de anticuerpos policlonales de captura y detección y de péptidos sintéticos para la generación de anticuerpos monoclonales.

B.) Anticuerpos de captura y detección

Para seleccionar los pares de anticuerpos para nuestro inmunoensayo, es necesario evaluar tanto la afinidad y especificidad como el título de los mismos.

Los pares de anticuerpos pueden estar formados por una pareja de anticuerpos monoclonales o policlonales (estos últimos deberán estar purificados por afinidad frente al antígeno), o por una combinación de ambos, siendo habitual la utilización de un anticuerpo de captura policlonal con el fin de inmovilizar la mayor cantidad posible de antígeno posible, junto con un anticuerpo de detección monoclonal para aumentar la especificidad.

En el caso de emplear dos anticuerpos monoclonales o bien dos policlonales, se utilizará como anticuerpo de captura aquel que presente una mayor afinidad por el antígeno.

Es importante verificar que la unión del anticuerpo de captura no modifica las propiedades del antígeno, impidiendo el reconocimiento del epítopo por parte del anticuerpo de detección.

C.) Método de screening

Una vez tenemos una colección de anticuerpos primarios que se unen específicamente al antígeno de interés, es imprescindible diseñar un buen proceso de validación y screening para seleccionar los pares de anticuerpos óptimos para nuestro inmunoensayo.

En un primer paso, se recomienda realizar los ensayos con el mismo antígeno utilizado para la inmunización de los animales. Cada anticuerpo candidato de captura se ensayará junto a cada anticuerpo candidato de detección para obtener una curva estándar. Los mejores pares de anticuerpos se seleccionarán en función de:

  • La intensidad de la señal
  • La sensibilidad
  • El ruido de fondo

Los pares de anticuerpos seleccionados tras ese primer paso, se volverán a ensayar por ELISA frente a las muestras problema para confirmar que se reproducen los resultados.

La selección de pares de anticuerpos óptimos es fundamental para el desarrollo de determinados inmunoensayos como el ELISA tipo sándwich. Siguiendo unas sencillas pautas, se puede probar la combinación de distintos candidatos hasta dar con la pareja que mejor funcione en nuestro ensayo.

Aunque el proceso de screening no es complejo, sí que puede resultar tedioso y consumir un tiempo del que muchas veces no disponemos. Es por ello que en la actualidad existe una interesante oferta de pares de anticuerpos ya validados para su uso en ELISA tipo sándwich.

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