En el proceso de expresión y obtención de proteínas de fusión, una de las etapas más críticas y que mayores retos supone es la purificación de proteínas recombinantes. Este paso constituye un especial desafío cuando se trabaja con proteínas no caracterizadas, o con proteínas para las que no existe un buen anticuerpo.
Los tags de afinidad suelen ser, generalmente, pequeñas secuencias de aminoácidos cuya fusión a la proteína diana mediante técnicas de ingeniería genética permite, en teoría, la purificación de cualquier proteína mediante cromatografía de afinidad, sin necesidad de tener un conocimiento previo sobre las propiedades bioquímicas de la misma.
En esta entrada os traemos una recopilación de los tags de afinidad más utilizados para la purificación de proteínas recombinantes.
Tags para la purificación de proteínas recombinantes
La elección del tag de fusión que queramos añadir a nuestra proteína diana, dependerá principalmente de las prioridades de purificación, el tamaño del tag y el coste de las resinas de cromatografía.
Aunque la purificación de proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad frente a los tags de fusión suele utilizarse generalmente como paso único, en los casos en los que se requiera una mayor pureza esta técnica puede utilizarse como paso preliminar dentro de un procedimiento de purificación más complejo, o bien fusionando simultáneamente dos tags a los extremos 3’ y 5’ de la proteína diana, y llevando a cabo una doble purificación por afinidad frente a cada uno de ellos.
A continuación resumimos las características de los tags de afinidad más utilizados en la purificación de proteínas recombinantes:
1.- HIS tag
- Nombre: Polihistidina
- Tamaño: 6 aa
- Características:
- Es el tag más comúnmente utilizado.
- Debido a su pequeño tamaño, rara vez interfiere en la función de la proteína.
- Así mismo, la elución mediante gradiente de imidazol es poco agresiva, lo que permite preservar la inmunogenicidad de las proteínas.
- La purificación de proteínas recombinantes con tag de histidina puede realizarse mediante IMAC (Inmobilized Metal Affinity Chromatography), generalmente con columnas de Ni2+, o mediante anticuerpos primarios anti-polihistidina.
- En el caso de las proteínas expresadas en E. coli, con la purificación mediante el tag de histidinas puede llegar a alcanzarse una pureza del 80%. Sin embargo, en otros sistemas como células de insecto o mamífero, la pureza alcanzada puede ser menor debido al elevado porcentaje de residuos de histidina que presentan las proteínas en estos sistemas.
2.- GST tag
- Nombre: Glutathione S-transferasa
- Tamaño: 26 kDa
- Características:
- Otro de los tags más populares y uno de los de mayor tamaño.
- Tiene la capacidad de incrementar los niveles de expresión y solubilidad de la proteína de fusión.
- Debido a su gran tamaño, podría interferir con la función de la proteína.
- La elución con glutathione es poco agresiva, lo que permite preservar la funcionalidad y antigenicidad de la proteína de fusión en la mayoría de los casos.
- La purificación de proteínas recombinantes con tag de GST pueden realizarse mediante resinas de glutathione, y mediante anticuerpos anti-GST.
- El tag de GST puede separarse y eliminarse de la proteína de fusión, mientras aún está unida a la resina.
- Las proteínas unidas a GST generalmente se expresan en altos niveles en E. coli, lo que puede dar lugar a la formación de agregados en cuerpos de inclusión.
3.- MBP tag
- Nombre: Maltose-binding protein.
- Tamaño: 45kDa
- Características:
- Es el tag de mayor tamaño.
- Tiene la capacidad de incrementar los niveles de expresión y solubilidad de la proteína de fusión, contribuyendo también a su correcto plegado.
- Debido a su gran tamaño, podría interferir con la función de la proteína.
- La purificación de proteínas recombinantes con tag de MBP pueden purificarse mediante resinas de amilosa y anticuerpos anti-MBP.
- El tag de MBP no puede separarse y eliminarse de la proteína de fusión mientras aún está unida a la resina, siendo preciso eluir la proteína previamente a la escisión.
- Al igual que ocurre con el tag de GST, las proteínas unidas a MBP generalmente se expresan en altos niveles en E. coli, lo que puede dar lugar a la formación de agregados en cuerpos de inclusión.
4.- CBP tag
- Nombre: Calmodulin-binding peptide
- Tamaño: 26aa / 4kDa
- Características:
- Al tratarse de un tag de pequeño tamaño, la probabilidad de que afecte a las propiedades de la proteína de interés es muy baja.
- Una de las principales ventajas de este sistema radica en las condiciones suaves de unión y elución, que contribuyen a que la proteína de fusión mantenga su forma nativa tras la purificación.
5.- Tags basados en estreptavidina/biotina
- Nombre: BCCP (péptido señal de biotinilación) + biotina
- Tamaño: 100aa
- Características:
- Las proteínas que incluyen el tag BCCP, pueden ser biotiniladas mediante la enzima biotin ligasa.
- Una vez biotinilada, la purificación de proteínas recombinantes puede llevarse a cabo mediante cromatografía de afinidad con resina de avidina.
- Mientras que la unión no específica a la avidina en E. coli es muy baja, en otros sistemas como las células de mamífero, podrían eluirse simultáneamente otras proteínas distintas a la proteína diana.
6.- Epitope tags
- Nombre: FLAG, Hemaglutinina (HA), c-myc, T7, etc.
- Tamaño: 8 aa (FLAG), 31aa (HA), 11aa (c-myc), 11aa (T7)
- Características:
- Los epitope tags suelen ser pequeñas secuencias que actúan a nivel de los epítopos de la proteína de interés (sitios de reconocimiento de los anticuerpos).
- La purificación de proteínas recombinantes con epitope tags puede realizarse mediante cromatografía de afinidad, inmovilizando anticuerpos primarios específicos.
- No es el sistema más recomendable en el caso de proteínas altamente insolubles o con tendencia a formar agregados.
En conclusión, la elección del tag (y del método de escisión si fuera el caso) para la purificación de proteínas recombinantes, deberá hacerse atendiendo a las particularidades de nuestra proteína de interés. Para las proteínas que se expresan bien, sería suficiente el uso de alguno de los tags de afinidad más simples como la cola de polihistidina, mientras que en el caso de aquellas proteínas que presenten mayores dificultades de expresión, habría que recurrir a tags que además faciliten la solubilidad y el plegado como la GST o MBP.
Por otro lado, también hay que tener muy en cuenta que los tags de pequeño tamaño apenas interfieren con la estructura, la actividad y las características de la proteína diana, mientras que los tags de mayor tamaño (GST, MBP) pueden llegar a impactar significativamente tanto en la estructura como en la actividad biológica de la proteína de fusión, y habría que valorar en cada caso la conveniencia de escindir dicho tag una vez purificada la proteína de interés.
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