Aproximadamente el 30% de las proteínas presentes en organismos eucariotas están fosforiladas, por lo que si hay proteínas involucradas en tu proyecto de investigación, es más que probable que en algún momento necesites estudiar distintos aspectos de la fosforilación de las mismas.

En esta entrada os traemos una recopilación de técnicas para estudiar la fosforilación de las proteínas, en función de la información que se quiera obtener.

 

4 Técnicas para estudiar la Fosforilación de las Proteínas

 

1.- Radioisótopos para estudios in vivo

Se trata de incubar las células vivas con 32P-ortofosfato radiomarcado, de manera que la actividad kinasa transfiera este radiomarcaje a las proteínas sustrato, permitiendo la detección de esta actividad.

Esta técnica resulta de utilidad para:

  • Conocer si tu proteína sufre fosforilación.
  • Realizar el ensayo bajo distintas condiciones experimentales para determinar cuándo se da la fosforilación.

Sin embargo, no brinda información sobre:

  • El sitio específico en el que ocurre la fosforilación de las proteínas.
  • La kinasa implicada en la reacción de fosforilación de las proteínas.

Como inconveniente de esta técnica cabe destacar lo laboriosa que resulta y el tiempo que requiere, así como la exigencia de utilizar medidas de seguridad adicionales para la manipulación del material radiactivo.

 

2.- Estudios de actividad de kinasas in vitro

En este caso, se trata de incubar la kinasa de interés con un sustrato exógeno en presencia de ATP marcado, y cuantificar la cantidad de marcaje incorporado para medir la actividad enzimática de la kinasa. En función del tipo de marcaje del ATP, la detección se llevará a cabo por colorimetría, medida de la radiactividad o fluorescencia.

Esta técnica resulta de utilidad para:

  • Estudiar la actividad potencial de una kinasa para un sustrato.
  • Estudios competitivos.

Sin embargo, no brinda información sobre:

  • Los niveles reales de actividad fisiológica de la kinasa.
  • Actividad respecto a fosfatasas.
  • Funcionalidad de las kinasas.

 

3.- Anticuerpos fosfoespecíficos

Los anticuerpos fosfoespecíficos son aquellos que reconocen de manera específica la forma fosforilada de una determinada proteína, por lo que resultan una herramienta de gran valor para estudiar la fosforilación de las proteínas.

Estos anticuerpos fosfoespecíficos pueden utilizarse en diversas técnicas, como por ejemplo:

  • Western Blot

Permite determinar el estado de fosforilación de una determinada proteína. Al utilizar anticuerpos fosfoespecíficos, cabe hacer hincapié en la importancia de la correcta elección del agente de bloqueo, ya que la leche (o los agentes que la contengan) contiene fosfoproteínas que podrían interactuar con esos anticuerpos, dando lugar a resultados erróneos. (Recuerda este post con consejos para elegir el buffer de bloqueo)

  • ELISA  

La técnica ELISA con anticuerpos fosfoespecíficos permite la detección y cuantificación de la proteína fosforilada presente en la muestra, así como la facilidad para analizar una gran cantidad de muestras de manera simultánea y semiautomatizada.

Si llevamos a cabo un ELISA tipo sándwich, el ensayo será mucho más específico, al utilizar un anticuerpo fosfoespecífico como anticuerpo de detección.

  • Citometría de flujo  

Esta técnica permite estudiar la fosforilación de las proteínas célula a célula.

  • Inmunohistoquímica 

La IHC, además de permitir estudiar de la fosforilación de las proteínas célula por célula, posibilita la localización intracelular de las mismas.

  • Microarrays de anticuerpos fosfoespecíficos 

Estos microarrays son de gran utilidad para estudiar sistemas de señalización mediados por fosforilación de las proteínas.

 

4.- Espectrometría de masas

Las proteínas fosforiladas, al igual que el resto de proteínas, pueden también analizarse mediante espectrometría de masas.

En este caso, debido a que las proteínas fosforiladas emiten una señal más débil per se y que su concentración relativa en las muestras suele ser muy baja respecto al resto de proteínas, la señal puede verse enmascarada por la que emiten las proteínas no fosforiladas.

Es por ello que, antes de llevar a cabo el análisis para estudiar la fosforilación de las proteínas por espectrometría de masas, se recomienda realizar alguna técnica de enriquecimiento de la muestra fosforilada mediante IMAC, purificación mediante anticuerpos fosfoespecíficos o inmunoprecipitación, entre otras.

 

La fosforilación es uno de los mecanismos celulares más importantes para la regulación de la función de las proteínas así como para la transmisión de señales. Esperamos que esta recopilación de técnicas para estudiar la fosforilación de las proteínas os haya resultado de interés.

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