Los anticuerpos son una de las herramientas de uso más extendido en los laboratorios de investigación para identificar, bloquear o incluso aislar diversas moléculas. Debido a la especificidad que se les presupone, es fundamental validar los anticuerpos para el uso en cada una de las técnicas en las que se vayan a aplicar, ya que, como hemos visto en otras ocasiones, un anticuerpos puede resultar muy específico por ejemplo en un inmunoensayo ELISA, y sin embargo dar una señal muy débil en otro tipo de ensayos como el Western Blot.

Validar los anticuerpos implica testar los siguientes aspectos:

  • Especificidad del anticuerpo en la técnica seleccionada
  • Afinidad por el antígeno
  • Reproducibilidad entre ensayos

En esta entrada recopilamos algunos tips para orientarte a la hora de validar los anticuerpos y definir su especificidad.

Principales problemas con los Anticuerpos, ¿cómo resolverlos?

Los problemas que más habitualmente se derivan del uso de anticuerpos son la reactividad cruzada, la variabilidad entre lotes y su aplicación en una técnica incorrecta.

1.- REACTIVIDAD CRUZADA

  • Problema: El anticuerpos no solo se une al antígeno diana, sino también a otras proteínas presentes en la muestra.

2.- VARIABILIDAD ENTRE LOTES

  • Problema: Es más frecuente en el caso de los anticuerpos policlonales, ya que un mismo anticuerpo producido en distintos animales, podría funcionar de manera ligeramente diferente.

3.- APLICACIÓN ERRÓNEA

  • Problema: Las diferentes técnicas y condiciones experimentales en las que se lleva a cabo cada una de ellas pueden llegar a modificar el plegamiento de la proteína diana, y en consecuencia, su capacidad para unirse al anticuerpo.

Para evitar cualquiera de estos problemas, es de vital importancia validar los anticuerpos antes de su uso.

Pero, ¿cómo hacerlo? Presta atención a los ensayos que enumeramos a continuación.

Ensayos para validar los anticuerpos

Los anticuerpos pueden validarse mediante multitud de ensayos funcionales, cada uno de los cuales presenta sus ventajas e inconvenientes:

ELISA

  • Pros:
    • Ensayo cuantitativo, permite confirmar la sensibilidad.
    • Ensayo de alto rendimiento, puede procesarse un alto número de muestras de manera simultánea.
  • Contras:
    • No determina si el anticuerpo puede dar lugar a reactividad cruzada.

WESTERN BLOT (WB)

  • Pros:
    • Ensayo cualitativo, fácil y sencillo de llevar a cabo.
    • Ideal para proteínas desnaturalizadas.
  • Contras:
    • Difícil de optimizar.
    • Requiere mucho tiempo.
    • Solo se pueden testar unos pocos anticuerpos al mismo tiempo.

INMUNOHISTOQUÍMICA (IHC) / INMUNOCITOQUÍMICA (ICC)

  • Pros:
    • Técnicas de relativo bajo coste.
    • Ensayo cualitativo.
  • Contras:
    • Difícil de estandarizar.
    • La accesibilidad de los epítopos puede variar en tejidos fijados.
    • No determina si el anticuerpo reconoce otras proteínas con la misma localización celular de forma no específica.

CITOMETRÍA DE FLUJO (FC)

  • Pros:
    • Ensayo de alto rendimiento, puede procesarse un alto número de muestras de manera simultánea.
    • Fácil de optimizar.
  • Contras:
    • No determina si el anticuerpo puede dar lugar a reactividad cruzada.

siRNA KNOCKDOWN

  • Pros:
    • Las líneas celulares KnockDown se pueden utilizar en todos los ensayos: WB, IHC/ICC , FC…
  • Contras:
    • El KnockDown es transitorio.
    • Difícil de optimizar.

LÍNEAS CELULARES KNOCKOUT (KO)

  • Pros:
    • Garantizan que no habrá expresión del gen diana, por lo que son inmejorables controles negativos, garantizando la especificidad del anticuerpo.
    • Pueden utilizarse en todos los ensayos: WB, IHC/ICC, FC…
  • Contras:
    • Las líneas celulares KnockOut frente a genes específicos no siempre son viables.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS)

  • Pros:
    • Ensayos de alto rendimiento, puede procesarse un alto número de muestras de manera simultánea.
  • Contras:
    • Requiere el uso de un espectrómetro de masas y personal cualificado.
    • Difícil de optimizar.

 

Otras consideraciones a tener en cuenta para validar los anticuerpos

1.- La elección y preparación de las líneas celulares o muestras de tejidos, utilizando los correspondientes controles tanto positivos como negativos, y teniendo en cuenta si el anticuerpos reconoce la proteína en su forma nativa o desnaturalizada.

2.- Los protocolos, prestando especial atención y optimizando de forma individualizada los tiempos de incubación (periodos muy cortos pueden afectar a la sensibilidad, y por el contrario, tiempos de incubación excesivos podrían resultar en problemas de ruido de fondo), las diluciones de trabajo, las condiciones de bloqueo, etc.

3.- La elección de los buffers, determinando el óptimo en cada caso.

 

No dudes en consultarnos tus dudas a la hora de validar los anticuerpos, o en solicitarnos información técnica al respecto sobre los anticuerpos disponibles en nuestro catálogo.

 

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