3 Tips para la producción de anticuerpos monoclonales

En la actualidad, prácticamente todos los científicos utilizan anticuerpos monoclonales en sus investigaciones. El proceso de producción de anticuerpos monoclonales comienza con la inmunización de animales con una proteína o péptido purificado. A continuación, se utilizará el bazo de los animales que mejor responden para llevar a cabo la fusión de las células B con células inmortales. Con las líneas celulares parentales generadas, se llevarán a cabo diluciones limitantes para obtener líneas celulares o hibridomas de origen clonal. Finalmente, los últimos pasos consisten en la purificación de los anticuerpos presentes en el sobrenadante de las líneas celulares.

Es importante destacar que, para el desarrollo y la producción de anticuerpos monoclonales de forma exitosa, los pasos antes mencionados deben planificarse cuidadosamente. A continuación, describimos algunos consejos para el desarrollo de anticuerpos monoclonales, destacando aspectos clave que deben tenerse en cuenta.

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3 Tips para la producción de anticuerpos monoclonales

1. Inmunogenicidad del antígeno: ¿qué antígeno utilizar?

La inmunogenicidad del antígeno se define como su capacidad para provocar una respuesta inmune. Por lo tanto, es esencial elegir bien qué antígeno usar para el desarrollo de anticuerpos monoclonales.

Una cosa que debe tenerse en cuenta es la naturaleza de la molécula antigénica. Como regla general, tres factores juegan un papel importante:

(1) Baja similitud con antígenos presentes en la especie a inmunizar, para evitar que el antígeno sea reconocido por el sistema inmunológico como «propio»

(2) Alto peso molecular (PM), ya que aquellos antígenos con un PM por debajo 1000, no son inmunogénicos

(3) Cierto grado de complejidad molecular, ya que es también un mejor desencadenante de una respuesta inmune en comparación con aquellas moléculas más simples a nivel estructural.

Además, algunas macromoléculas son más inmunogénicas que otras. Por ejemplo, los lípidos o ácidos nucleicos no suelen ser inmunogénicos, a menos que estén conjugados con una proteína transportadora. Lo mismo ocurre con los carbohidratos, a excepción de los que tienen una estructura compleja o están ligados a una proteína (glicoproteínas). Dada su complejidad estructural, las proteínas tienden a ser inmunógenos fuertes. Un aspecto clave a tener en cuenta a la hora de utilizar una proteína para inmunización es su pureza, ya que una pequeña contaminación (con antígenos bacterianos) puede ser inmunodominante. Esto es, los anticuerpos generados serán predominantemente contra el contaminante en lugar de contra la proteína deseada.

A la hora de seleccionar el antígeno para desarrollar un anticuerpo contra una proteína diana, también se puede utilizar un péptido en lugar de una proteína. Se recomienda el uso de un péptido cuando su proteína diana es muy similar a otras proteínas o es difícil de expresar o purificar. El uso de un péptido también es la opción recomendada para desarrollar anticuerpos contra una modificación postraduccional particular, ya que se reduce el número de epítopos potenciales disponibles. Además, usar un péptido como antígeno reduce el coste y es más rápido que usar una proteína. Sin embargo, una de las principales limitaciones del uso de péptidos antigénicos en lugar de proteínas, es que generan anticuerpos que solo reconocen epítopos lineales.

En contraposición, el uso de proteínas como antígeno inducirá anticuerpos contra múltiples epítopos, algunos de los cuales podrían ser de naturaleza conformacional en lugar de lineal. Por tanto, los anticuerpos anti-proteína se comportarán generalmente mejor en aplicaciones de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia u otras aplicaciones en las que se reconozca la proteína en forma nativa. No obstante, el uso de una proteína como antígeno es más probable que derive en una reactividad cruzada inespecífica con proteínas que contengan epítopos homólogos.

2. Inmunización con antígenos peptídicos: ¿qué debo saber?

Si has decidido utilizar un péptido para la inmunización, hay algunas cosas que debes de considerar para optimizar la elección del péptido y la estrategia de inmunización. Actualmente existen sofisticados logaritmos que evalúan varios factores y determinan cuán inmunogénico se cree que será determinado péptido. Aquí resumimos algunos de estos factores:

• Análisis de la secuencia y estructura de la proteína: conociendo la estructura de la proteína, se puede elegir un péptido que sea fácilmente accesible para los anticuerpos. También es importante evitar aquellos péptidos que podrían estar presentes en proteínas estrechamente relacionadas, como péptidos situados en dominio comunes, para evitar así la reactividad cruzada.
• Longitud del péptido: la mayoría de las secuencias de péptidos tendrán una longitud de 10 a 20 aminoácidos. Los péptidos de esta longitud de secuencia son generalmente solubles en soluciones acuosas y es menos probable que formen estructuras secundarias, que podrían no estar presentes en la estructura del antígeno nativo.
• Flexibilidad, hidrofilicidad e hidrofobicidad de los péptidos: los anticuerpos tienden a unirse a los epítopos que se encuentran en la superficie de las proteínas. Los residuos en la superficie tienden a ser hidrófilos, mientras que los residuos hidrófobos están enterrados en el interior. Por lo tanto, un péptido antigénico ideal debería situarse en la superficie de la proteína y ser hidrófilo. Como regla general, se recomienda diseñar un péptido de modo que el 30% de sus residuos sean hidrófilos o tengan carga (lisina, arginina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina y asparagina). Además, los anticuerpos tienden a unirse a epítopos que muestran cierta flexibilidad, razón por la cual también se debe considerar la flexibilidad de los péptidos como un factor a tener en cuenta.
• Consideraciones importantes: se deben evitar los péptidos ubicados en regiones transmembrana u otras ubicaciones dentro de la proteína que no son accesibles. También deben evitarse los motivos de secuencia, como el motivo arginina, glicina, aspártico (RGD) o sitios de unión a GTP, ya que pueden provocar reactividad cruzada.
• Solubilidad de los péptidos: la composición de aminoácidos influirá fuertemente en la solubilidad de los péptidos. Los aminoácidos hidrófobos, como leucina, valina, isoleucina, metionina, triptófano o fenilalanina, tienen una solubilidad limitada en una solución acuosa. Se aconseja mantener el número de aminoácidos hidrófobos por debajo del 50%. También se recomienda que el último aminoácido dentro de la secuencia del péptido sea hidrófilo, ya que esto promueve la solubilidad.
• Proteína portadora o carrier: el peso molecular del péptido en sí no es suficiente para provocar una respuesta inmune. Por tanto, los péptidos han de conjugarse covalentemente a una proteína carrier. La proteína carrier, como es grande y compleja, confiere inmunogenicidad y por tanto se generarán anticuerpos tanto contra la proteína carrier como contra el péptido conjugado. Las dos proteínas carrier más utilizadas son la hemocianina de lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin, KLH) y la albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, BSA). Pueden usarse diversos métodos para la unión de péptidos a grupos de superficie dentro de proteínas carrier. Una estrategia común es conjugar el carrier mediante grupos sulfhidrilo, que están presentes en los residuos de cisteína. Por tanto, si el péptido contiene un residuo de cisteína, éste puede usarse directamente para la conjugación. Es preferible que el péptido no se conjugue en múltiples residuos de aminoácidos, sino que la unión al carrier se produzca a través del aminoácido C- o N-terminal del péptido. En base a esto, se puede añadir una cisteína terminal a la secuencia del péptido para permitir la conjugación de la proteína carrier. En estos casos, se debe de tomar otra decisión con respecto a qué extremo del péptido añadir la cisteína y, por lo tanto, conjugar el carrier. Debido a que la proteína carrier puede enmascarar estéricamente el epítopo de interés dentro del péptido, se recomienda colocar la cisteína en el extremo más alejado de dicho epítopo. Con respecto a la proteína carrier a la que conjugar el péptido, BSA se utiliza con frecuencia en el desarrollo de inmunoensayos que permiten el cribado de los anticuerpos generados tras la inmunización. También se utiliza como agente de bloqueo y en otras aplicaciones. Por este motivo, para evitar la reactividad cruzada, a menudo se utiliza KLH como proteína carrier para generar la respuesta inmune. Independientemente de cuál sea la proteína carrier que se utiliza durante la inmunización, deben de usarse diferentes proteínas carriers en las etapas de inmunización y cribado para seleccionar aquellos anticuerpos producidos contra el epítopo de interés y no contra el carrier.

3. Inmunización de los animales

Otro aspecto a decidir es la especie de animal que se utilizará para la inmunización. En este sentido, hay algunas consideraciones a tener en cuenta. La presencia de proteínas homólogas en la especie a inmunizar aumentará la posibilidad de que el antígeno sea reconocido como «propio» impidiendo o dificultando la generación de anticuerpos.

Por otro lado, la edad de los animales también juega un papel importante en la generación de la respuesta inmune, ya que los adultos jóvenes desencadenan respuestas inmunes más robustas que sus aquellos que son más mayores. Debido a esto, generalmente se utilizan ratones y conejos de 6 y 8 semanas de edad, respectivamente.

El protocolo de inyección también debe diseñarse cuidadosamente. En este sentido, hay algunos puntos a considerar:

• Vía de inyección: la elección de la vía de inyección dependerá de la especie animal a inmunizar. Las diferentes rutas de inyección tendrán diferentes ventajas y desventajas. La ruta subcutánea (s.c) es típicamente la ruta preferida y la más utilizada. El motivo es que esta vía permite monitorizar procesos inflamatorios de forma muy sencilla y también permite administrar grandes volúmenes. Otras vías de inyección como la intramuscular o la intravenosa, a pesar de que puede ofrecer una mejor adsorción (muscular) o distribución (intravenosa) del antígeno, no son compatibles con ciertos adyuvantes, como los de naturaleza oleosa.
• Volumen de inyección: el objetivo es utilizar el volumen más pequeño que sea capaz de provocar una respuesta inmunitaria. El volumen máximo que se puede utilizar también dependerá de la especie animal, la vía de administración y el tipo de antígeno o adyuvante utilizado.
• Inyecciones de refuerzo: después de la inmunización, se deben evaluar las respuestas de anticuerpos en el suero sanguíneo para determinar si podría ser necesaria una inyección de refuerzo. En general, pueden ser necesarias varias inyecciones de refuerzo si el título de anticuerpos ha alcanzado una meseta o está disminuyendo. Generalmente, se recomienda administrar los refuerzos cada 14 a 28 días, según el experimento.

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Referencias:

Lee, Bao-Shiang et al. 2016. “Antibody Production with Synthetic Peptides.” Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1474: 25–47.

Leenaars, Marlies, and Coenraad F M Hendriksen. 2005. “Critical Steps in the Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation  and Recommendations.” ILAR journal 46(3): 269–79.