5 métodos para cuantificar proteínas

La cuantificación precisa de las proteínas de una muestra es fundamental para el estudio de las mismas en infinidad de ámbitos de investigación.

Mientras que la cuantificación de una proteína específica puede llevarse a cabo mediante ensayos como Western Blot o ELISA, por espectrometría de masas (MS) o mediante otros métodos como los basados en nanopartículas, existen ensayos que permiten cuantificar la concentración de proteína total presente en una muestra.

Este último caso es en el que nos centramos recopilando una breve descripción de los 5 principales métodos para cuantificar proteínas totales.

5 métodos para cuantificar proteínas

1.- Ensayo de Bradford o azul Coomasie

Rango de concentración: 20-2000 ug/ml
Características:
- Método descrito en 1976.
- La tinción azul Coomasie cargada negativamente se une a proteínas con carga positiva.
- Se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina.
- La tinción en solución es de color rojo y absorbe a 465nm, mientras que al unirse a los aminoácidos básicos de una proteína se vuelve azul y absorbe a 595nm.
- La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra.
Ventajas:
- Se caracteriza por ser un método rápido, sencillo y compatible con los agentes reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución.
Limitaciones:
- No es válido para detectar proteínas de <3kDa.
- Es incompatible con detergentes como el SDS o el Triton X-100.

2.- Ensayo de Lowry

Rango de concentración: 10-1000 ug/ml
Características:
- Uno de los métodos para cuantificar proteínas más utilizado, fue desarrollado en 1951.
- Al igual que el ensayo BCA, se da una reacción en dos pasos:
  - Formación de complejos Cu-N (presente en la proteína).
  - Los complejos de tirosina y triptófano reaccionan con el reactivo Folin-Ciocalteau, dando lugar a un color azul verdoso que absorbe entre 650 y 750nm.
- La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra.
Ventajas:
- Es un ensayo muy sensible y preciso.
Limitaciones:
- Es incompatible con determinados reactivos químicos de uso común como el Tris, EDTA, DDT, 2-mercaptoetanol, carbohidratos, etc.

3.- Ácido Bicinconínico (BCA)

Rango de concentración: 20-2000 ug/ml
Características:
- Desarrollado en 1985.
- Ensayo colorimétrico donde la absorbancia será proporcional a la concentración de proteína presente en la muestra.
- Reacción en dos pasos:
  - Formación de complejos proteína-iones de cobre.
  - Formación de un quelato Cu-BCA que da lugar a una intensa coloración púrpura que absorbe a 562nm.
Ventajas:
- Es un método recomendado en el caso de muestras que contengan >5% de detergentes y/o agentes desnaturalizantes como urea o cloruro de guanidinio.
- Sensibilidad comparable a la del método de Lowry.
Limitaciones:
- Las muestras que contengan sustancias que interaccionan con el cobre, como por ejemplo el amoníaco, al igual que el EDTA, los azúcares reductores o los lípidos, pueden interferir con este ensayo.
- El color no es estable con el tiempo; se necesita controlar cuidadosamente el tiempo entre el análisis y la lectura en absorbancia.

4.- MÉTODO BIURET

Rango de concentración: 0.373-80 g/L
Características:
- Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren.
- La absorbancia del color producido es leída a 540 nm.
- La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo, en suero).
- El reactivo de Biuret se prepara del siguiente modo:
  - Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O.
  - Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante.
  - Guardar en frasco de plástico.
Ventajas:
- Es un método rápido, se puede completar en menos de 30 min.
- Es el método más simple para analizar proteínas.
Limitaciones:
- Método poco sensible.
- Requiere de al menos 2 a 4 mg de proteína por prueba.

5.- Absorción Ultravioleta (UV)

Rango de concentración: 0,1-100 ug/ml
Características:
- Mediante la medición de la absorción característica que presentan el triptófano y la tirosina a 280nm, este método estima la cantidad de proteína presente en la muestra.
Ventajas:
- Método rápido y relativamente sensible.
Limitaciones:
- Es incompatible con los métodos de extracción de proteínas que emplean detergentes y/o agentes desnaturalizantes.
- No es un método específico para proteínas, ya que otros compuestos que podría haber en la muestra también absorben a 280nm (como alcoholes o ácidos nucleicos, entre otros).
- Se requiere un sistema puro para poder utilizar este método.

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