El funcionamiento de un inmunoensayo viene determinado fundamentalmente por tres parámetros: especificidad, sensibilidad y reproducibilidad.
Centrándonos en los inmunoensayos ELISA, el desarrollo de un ensayo fiable, sensible y específico implica conocer fundamentos básicos de inmunología y química de proteínas, así como comprender el funcionamiento de los distintos buffers y otros componentes del kit.
En esta entrada te traemos 5 pasos esenciales mediante los que poder optimizar tu inmunoensayo.
5 pasos para optimizar tu inmunoensayo
1.- Elegir el anticuerpo correcto
A la hora de realizar un inmunoensayo, la correcta elección del anticuerpo es un paso crítico y fundamental.
Los anticuerpos monoclonales proporcionan una mayor especificidad debido a que reconocen un único epítopo, pero como contrapartida resultan menos sensibles. Por otro lado, los anticuerpos policlonales ofrecen la posibilidad de que varios de ellos se unan a un mismo antígeno, incrementando así la sensibilidad. Sin embargo, por esta misma razón, resultan mucho menos específicos, aumentando el riesgo de reactividad cruzada.
Como norma general, se suele elegir un anticuerpo monoclonal como anticuerpo de captura para que el ensayo resulte lo más sensible posible, y un anticuerpo policlonal como anticuerpo de detección para amplificar la señal.
No obstante, cada ensayo presenta sus características particulares, por lo que la elección de los anticuerpos deberá optimizarse para cada caso.
Recuerda esta entrada sobre Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales
2.- Procesar de la muestra adecuadamente
El tipo de muestra puede interferir en el funcionamiento del ensayo, así como determinar los componentes y/o reactivos del mismo.
Las muestras crudas con mezclas complejas como suero o extractos celulares, pueden ocasionar problemas tanto de sensibilidad como de especificidad ya que el analito suele encontrarse en muy baja concentración y puede existir reactividad cruzada con otros componentes de la muestra.
Siempre que sea posible, puede resultar interesante procesar la muestra para enriquecer el analito de interés y eliminar moléculas que puedan interferir con el correcto funcionamiento del inmunoensayo.
Recuerda esta entrada sobre Preparación de muestras para ELISA
3.- Reducir el ruido de fondo e incrementar la señal específica
El ruido de fondo puede minimizarse de distintas maneras, entre otras cosas, seleccionando los buffers correctos:
- Buffer de recubrimiento: deberá ser un buffer eficiente que permita estabilizar el anticuerpo o el antígeno sobre la placa manteniendo la estructura terciaria tridimensional de los mismos. Esto facilitará la unión antígeno-anticuerpo, mejorando así la señal específica.
- Buffer de bloqueo: al bloquear los espacios desocupados en los pocillos, se evitarán las uniones no específicas de la muestra y los componentes del ensayo, reduciendo así el ruido de fondo. La selección del buffer de bloqueo dependerá del antígeno y del conjugado enzimático en cada caso.
- Buffer de lavado: es un componente fundamental que permitirá lavar las placas entre los pasos de adición de los distintos reactivos, para eliminar el material residual que de otra manera podría ocasionar reactividad cruzada.
4.- Asegurar la reproducibilidad
Al preparar un inmunoensayo, es fundamental reducir al máximo la variabilidad entre placas con el fin de obtener resultados reproducibles. Pueden utilizarse buffers para la estabilización de proteínas que permitirán prepara todas las placas de una sola vez y utilizarlas en el tiempo con resultados precisos entre placas.
5.- Elegir el sustrato adecuado
El sustrato debe encajar con el conjugado enzimático que se utilice en cada ensayo, y la elección del mismo dependerá fundamentalmente de la sensibilidad de dicho sustrato (la intensidad de la señal producida por unidad de actividad enzimática) y del método de detección empleado.
Para terminar, te dejamos estas entradas relacionadas que también pueden ayudarte a optimizar tu inmunoensayo:
