El uso de la tecnología CRISPR-Cas está muy extendido en la investigación experimental y aplicada debido a su precisión y facilidad de uso en la edición de células, tejidos y organismos completos. De hecho, el sistema CRISPR se ha convertido en la herramienta de edición genómica favorita en los laboratorios de biología molecular. Una vez terminado un experimento CRISPR es fundamental comprobar si realmente ha sido efectivo. El ánalisis del éxito del experimento CRISPR consiste en verificar en qué punto ha cortado Cas9 y si el modelo CRISPR que se ha generado es correcto modificando el gen deseado.
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Análisis del éxito en la edición genética
Existen diferentes maneras de comprobar que el experimento CRISPR ha sido exitoso y que el gen diana se ha modificado de la manera deseada.
Un experimento se considera exitoso cuando se ha cortado el DNA diana únicamente en el punto para el cual se diseñó, introduciendo una mutación que produce un cambio en la expresión del gen diana.
Esquema básico de análisis
Existe un workflow que seguir a la hora de analizar el éxito de un experimento CRISPR:
- Determinar si un número significante de células del conjunto de la población mixta han sido editadas. Uno de los ensayos más utilizados es la digestión con endonucleasas.
- Aislar las células que han sido editadas eficientemente. En este paso, si se ha incluido fluorescencia en el vector, se puede hacer mediante FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) para separar las células que sí han sido editadas.
- Expandir los clones aislados.
- Screening de clones.
Detección de corte mediante PCR y endonucleasa
En esta técnica, se utilizan primers que flanquean la región específica que se desea modificar para amplificar mediante PCR la secuencia de interés. Posteriormente, los productos de PCR son desnaturalizados y rehibridados. En las zonas en las que Cas9 ha cortado, se producen heteroduplexes.
El siguiente paso es digerir los productos de PCR con una enzima capaz de reconocer los heteroduplex y cortar el DNA, como la endonucleasa T7. Por último, los productos se visualizan en un gel de agarosa, permitiendo distinguir fragmentos que han sido cortados de los que no. El que la enzima nucleasa haya cortado el DNA significa que Cas 9 ha cortado en la secuencia diana.
Esta técnica de análisis del éxito del experimiento CRISPR es sencilla y económica. Además, en función de la intensidad de la banda, se puede determinar el porcentaje de células mutadas. Por otro lado, algunas herramientas informáticas para el diseño de las guías CRISPR, ofrecen las secuencias para diseñar estos primers.
Sin embargo, esta técnica no reconoce modificaciones de un único nucleótido, ni ofrece discriminación alélica.
Secuenciación Sanger
Se utiliza sobre todo para analizar los clones individuales. Para ello se amplifica la región diana mediante PCR. Posteriormente, el amplicón se clona en un vector. Así, cada vector llevará solo una copia del gen en cuestión. Es el método considerado gold standard que, sin embargo, es costoso, ya que para determinar la secuencias de todas las copias del gen se necesita analizar varias colonias.
Una alternativa puede ser secuenciar directamente los amplicones. Sin embargo, también tiene inconvenientes, tales como que los alelos con diferentes secuencias (heterocigotos) pueden dar lugar a múltiples bandas en el cromatograma, resultando muy difícil de diferenciar. Por otro lado, existen programas que ayudan a decodificar esta información.
Next generation sequencing
Esta técnica de ánalisis del éxito del experimento CRISPR se puede utilizar tanto para analizar la población mixta, como clones de líneas celulares.
Existen varios programas específicos de CRISPR que facilitan el análisis de los resultados.
Este método, no solo nos permite determinar qué alelos fueron modificados, también nos permite averiguar exactamente qué indels se han generado (en el caso de un experimento KO), si se han producido efectos off-target; y también si la población es verdaderamente monoclonal.
Western Blot
Este ensayo resulta útil para comprobar si las células expresan la proteína que se ha modificado. Se utiliza un anticuerpo unido a alguna molécula que revele la presencia de la proteína.
Esta técnica es sencilla y útil cuando la mutación afecta a la expresión de la proteína. Si la mutación hace que la proteína no se exprese no aparecerá banda en el Western Blot porque el anticuerpo no encontrará proteína a la que unirse. En cambio, en el estado salvaje, la proteína se expresará y será entonces reconocida por el anticuerpo.
Sin embargo, existen casos en los que la mutación puede afectar a la funcionalidad de la proteína y no a su expresión. En este caso, al estar produciéndose la proteína ésta se detectaría, aunque en realidad se haya conseguido el objetivo, al no ser funcional.
Esta es sólo una muestra de los métodos más comunes para analizar el éxito de un experimento CRISPR. En Abyntek Biopharma, disponemos de anticuerpos para la realización de WB, ensayo de la endonucleasa T7, y también servicio de secuenciación con el objetivo de que puedas validar tu experimento CRISPR de la mejor manera.
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