La separación de una mezcla de proteínas mediante geles de SDS-PAGE se da en función de su tamaño, lo que permite calcular el peso molecular de una proteína de manera aproximada.
A pesar de que determinadas proteínas pueden sufrir hasta un 10% de desviación sobre su peso molecular real al utilizar este método (especialmente para aquellas proteínas con modificaciones post-traduccionales), el SDS-PAGE sigue siendo una de las técnicas más empleadas debido a su sencillez y simplicidad.
En esta entrada os resumimos cómo calcular el peso molecular de una proteína mediante SDS-PAGE en 5 sencillos pasos.
5 pasos para calcular el peso molecular de una proteína
Calcular el peso molecular de una proteína mediante SDS-PAGE es tan sencillo como comparar la movilidad electroforética de la proteína problema con la de una serie de proteínas de referencia cuyo peso molecular conocemos. Para ello, solo tenemos que seguir estos 5 sencillos pasos:
1.- Separar las proteínas
En primer lugar, se hace correr la muestra en la que se encuentra la proteína problema en el mismo gel junto a una serie de estándares o proteínas de referencia cuyo peso molecular se conoce.
2.- Procesar el gel con la tinción correspondiente
Una vez separadas las proteínas, el gel se procesa con la tinción pertinente para poder visualizar las bandas correspondientes a cada una de ellas.
3.- Calcular la distancia de migración relativa
Con las bandas definidas, se procede a calcular la distancia de migración relativa (Rf), o movilidad relativa, tanto de la proteína problema como de cada una de las proteínas de referencia, según la siguiente ecuación:
El frente del gel se refiere a la posición en el mismo de la banda correspondiente a un compuesto de referencia de movilidad máxima, como el azul de bromofenol.
La distancia de migración se mide en centímetros, pudiendo calcularse manualmente mediante el uso de una regla, o bien a través de un software específico.
4.- Generar un gráfico
Los valores del logaritmo del peso molecular correspondiente a cada una de las proteínas estándar se representa en una gráfica frente a los valores de la distancia de migración relativa (Rf) correspondientes a cada una de ellas. Esto nos dará como resultado una recta patrón (siempre que las proteínas estén totalmente desnaturalizadas, y el porcentaje de gel se adecue al rango de pesos moleculares de dichas proteínas).
5.- Extrapolar el valor de la proteína problema
Finalmente, se extrapola el valor de la distancia de migración relativa (Rf) de la proteína problema en la gráfica para obtener su peso molecular estimado. Et voilà!
Entradas relacionadas:
- Cómo hacer un SDS-PAGE: Trucos y Consejos
- 7 tips para transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot
- 5 métodos para cuantificar proteínas
- Cómo medir la calidad de las proteínas
NEWSLETTER ¡No olvides suscribirte a nuestra newsletter aquí para recibir las actualizaciones semanales de este blog de investigación y anticuerpos!
