Cada vez que una muestra que contiene células, proteínas, ácidos nucleicos (DNA / RNA), etc. se somete a ciclos de congelación-descongelación, ocurren una serie de procesos que pueden dañar la estructura celular, proteica o del DNA, dando lugar a la degradación de la muestra, y afectando por tanto directamente a los resultados del ensayo.
Este daño puede ser mayor o menor dependiendo de factores como la pureza de la muestra, los componentes del buffer o las proteínas endógenas que puedan actuar como crioprotectores, entre otros.
En esta entrada resumimos los factores causantes del daño durante los ciclos de congelación-descongelación, y de qué manera podemos evitarlos.
¿Cuáles son los factores causantes del daño durante los ciclos de congelación-descongelación?
1.- Formación de cristales de hielo
Los cristales de hielo que se forman durante el proceso de congelación-descongelación, pueden causar la ruptura física de la membrana celular. La formación de estos cristales es mucho más acusada en los casos en los que la congelación se lleva a cabo de forma rápida.
Esta ruptura de las membranas puede reducir considerablemente la viabilidad celular en caso de células vivas y microorganismos.
2.- Cambios en el pH
Otra de las consecuencias de la formación de cristales, además de la ruptura de las membranas, es que las sales y proteínas presentes en el buffer pueden incrementar su concentración dando lugar a cambios en el pH.
Estos cambios podrían ocasionar la desnaturalización de algunas proteínas y la degradación de los ácidos nucleicos.
3.- Daño por estrés oxidativo
El estrés oxidativo puede generarse por diversos mecanismos, provocando daño molecular en el DNA, las proteínas y los componentes lipídicos.
¿Cómo reducir el daño causado por los ciclos de congelación-descongelación?
- Evitando los ciclos de congelación-descongelación
Parece obvio, pero es preciso tomar todas las medidas oportunas antes de almacenar la muestra, para evitar o reducir, en la medida de lo posible, los ciclos de congelación-descongelación a los que se verá posteriormente sometida.
La forma más sencilla de evitar que la muestra se vea continuamente sometida a ciclos de congelación-descongelación es alicuotándola antes de su primera congelación. De esta manera únicamente se descongelará la muestra que vaya a utilizarse para cada ensayo, sin que el resto se exponga a daños ni degradación.
Otra forma sería el uso de soluciones que permitan el almacenamiento a largo plazo en otras condiciones como refrigeración o a temperatura ambiente. (Recuerda esta entrada sobre A qué temperatura almacenar muestras biológicas)
- Mediante el uso de crioprotectores
En el caso de los crioprotectores intracelulares, estos penetran en las células para evitar la formación de cristales de hielo y la consecuente ruptura de las membranas celulares. Los más comunes son el DMSO, el glicerol o el etilenglicol.
Por otro lado, los crioprotectores extracelulares actúan reduciendo el efecto hiperosmótico durante el proceso de congelación. Entre los de uso más común se encuentran la sacarosa, la dextrosa o la polivinilpirrolidona. En este caso, la viabilidad celular tras la congelación suele ser sensiblemente menor que la observada con los crioprotectores intracelulares.
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