La citometría de flujo es una poderosa herramienta con aplicaciones en múltiples campos como la biología del cáncer, la inmunología, las enfermedades infecciosas o la biología molecular.

Se trata de una tecnología ampliamente utilizada para el estudio de la respuesta del sistema inmunológico a la inflamación, patógenos y adicionalmente al cáncer; permite la caracterización de poblaciones celulares mixtas a partir de diferentes tipos de muestras, ya sean tejidos, sangre, tumores sólidos o médula ósea.

Una de las consideraciones más importantes en un experimento de citometría de flujo es decidir qué anticuerpos usar. En Abyntek Biopharma sabemos que la citometría de flujo es una técnica de alta sensibilidad. Por lo tanto, brindamos un servicio personalizado de anticuerpos de calidad excepcional para este propósito.

Aplicaciones de la citometría de flujo en oncología

Immunofenotipado

El inmunofenotipado es la aplicación más utilizada en citometría de flujo. Se basa en la capacidad única de la citometría de flujo para analizar simultáneamente poblaciones de células mixtas. Las células deben teñirse primero con anticuerpos conjugados con fluorocromos que están dirigidos contra los antígenos de la superficie celular.

Se utiliza una nomenclatura común para definir estos anticuerpos monoclonales específicos, denominada grupo de números de diferenciación (CD). La gran mayoría de las células inmunitarias tienen marcadores CD específicos que las definen como población.

Algunos ejemplos se enumeran en la tabla 1 y se representan en la figura 1:

Tabla 1. Marcadores celulares para citometría de flujo utilizados en oncología

Además, la tinción de células vivas/muertas se usa comúnmente para diferenciar las células vivas y muertas.

Figura 1. Tipos de células que se encuentran típicamente en un entorno tumoral en el carcinoma ductal.

Proliferación y análisis del ciclo celular

Otro uso de la citometría es el estudio de la proliferación celular. Existen varios marcadores para detectar eventos relacionados con la proliferación, como la incorporación de análogos de timidina (BrdU) en el ADN replicante, el seguimiento generacional mediante tinciones hereditarias (CFSE) y la expresión de antígenos relacionados con la proliferación (Ki67, PCNA).

El procedimiento BrdU utiliza ADNasa para exponer la BrdU para la tinción de anticuerpos. CFSE y otros colorantes similares atraviesan la membrana celular en las células vivas y se unen covalente y permanentemente a las estructuras intracelulares. Por lo tanto, la siguiente generación de células heredará el tinte, lo que permitirá un análisis de proliferación a largo plazo.

La presencia de algunos biomarcadores como Ki67y PCNA es indicativa de proliferación celular. Ki67 se expresa en todas las fases de proliferación celular pero no durante la quiescencia celular. Por el contrario, el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) es necesario para la replicación del ADN.

También es posible utilizar la citometría de flujo para analizar el ciclo celular. Estos ensayos se basan en la utilización de un colorante de unión al ADN.

Apoptosis y regulación

La apoptosis es un fenómeno muy estudiado en inmunología y cáncer. Es un proceso fuertemente regulado y controlado utilizado por la célula para mantener la homeostasis mediante muerte celular programada.

Mediante citometría de flujo se pueden detectar diferentes eventos asociados con la apoptosis:

EventoMétodo de detección
Traslocación de la membrana plasmáticaAnexina V
Digestión de AND mediante endonucleaseEnsayo del TUNEL
Activación de caspasaAnticuerpo
Vía de señalización de caspasaAntibody anti-caspase 3 y tinción intracelular
Apoptosis mitocondrialTinción
Condensación de la cromatinaHoescht 33342

Análisis de puntos de control del Sistema inmune

Los puntos de control inmunológico son reguladores del sistema inmune. Regulan la capacidad del sistema inmunitario para distinguirse. Las células tumorales utilizan ciertas vías de puntos de control inmunitarios como método de supervivencia, en particular mediante la inhibición de la actividad de las células T o las células NK. Ya hemos hablado en el post anterior de su importancia en la autotolerancia inmunológica.

En un microambiente tumoral, las células T activadas se reclutan para eliminar las células tumorales. Sin embargo, las células tumorales secretan factores activadores de Treg. Luego, las funciones de las células T son suprimidas por la respuesta reguladora de Treg. Las células tumorales expresan el represor del punto de control inmunitario PD-L1. Por lo tanto, las células T se agotan por la estimulación persistente del receptor PD-1 (Figura 2).

Figura 2: Puntos de control

Usos complementarios

No importa qué tipo de células sean el objetivo de la citometría de flujo, es posible utilizar esta técnica para contar el número absoluto de células y, además, clasificarlas.

Para contar las células, junto con la muestra se utilizan perlas fluorescentes de una concentración conocida. El número de perlas adquiridas en la misma muestra se compara con el número de células de la población de interés en la muestra para determinar así su concentración.

Además, es posible separar poblaciones celulares si se dispone de un citómetro de flujo con capacidad de clasificación celular. La clasificación de células permite separar y purificar las células o partículas de la muestra. Esencialmente, cualquier célula o partícula que pueda expresar fluorescencia puede separarse. Algunos tipos de células que se clasifican comúnmente son los linfocitos que se infiltran en tumores, células tumorales, células madre, células transfectadas que expresan una proteína fluorescente y poblaciones de glóbulos blancos.

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Bibliografía

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