La fosforilación es una de las modificaciones postraduccionales más importantes que pueden sufrir las proteínas desde el punto de vista funcional. De ello depende la regulación de un amplio rango de actividades celulares como el ciclo celular, la diferenciación celular, el metabolismo, la comunicación neuronal… Y es por ello que las alteraciones en la fosforilación están implicadas en distintos tipos de patologías tan diversas como el cáncer (alteraciones en la división celular) o problemas de aprendizaje o memoria (por alteración en la transducción de las señales neuronales).
El desarrollo de anticuerpos fosfoespecíficos ha permitido mejorar los métodos tradicionales para el estudio de la señalización celular mediante el desarrollo de nuevos inmunoensayos. El éxito en la detección al utilizar anticuerpos fosfoespecíficos depende directamente de la especificidad y la afinidad de ese anticuerpo hacia la proteína fosforilada de interés.
¿Cómo se obtienen los anticuerpos fosfoespecíficos?
A la hora de producir nuevos anticuerpos fosfoespecífico, existen dos elementos cruciales que determinarán el éxito del proyecto: el diseño del antígeno y la purificación.
1.- El diseño del antígeno
Si el primer paso crítico para la producción de cualquier anticuerpo es el diseño y la obtención del antígeno (puedes profundizar sobre este tema aquí), lo es aún más si cabe en el caso de los anticuerpos fosfoespecíficos. La especificidad y la utilidad del anticuerpo dependerán directamente del péptido con el que se inmunice a los animales.
En este sentido, son varios los elementos a tener en cuenta a la hora de proceder al diseño del péptido idóneo, pero cabe prestar especial interés a tres factores:
- Homología: Es necesario hacer un Blast de la proteína de interés para identificar y evitar posibles homologías del péptido que seleccionemos con otras proteínas, o incluso con otras zonas dentro de la misma proteína que no interese que el anticuerpo reconozca. Este paso evitará en gran parte potenciales problemas de reactividad cruzada.
- Longitud de la secuencia: A la hora de obtener anticuerpos fosfoespecíficos, el péptido que utilicemos como antígeno presentará generalmente una o dos forforilaciones en residuos de tirosina, serina y/o treonina. Con el fin de que los anticuerpos que se generen reconozcan el epítopo que contiene las fosforilaciones y no cualquier otro dentro del mismo péptido, conviene seleccionar una secuencia peptídica lo más corta posible dentro de lo que otras limitaciones puedan permitir. De esta manera, aseguraremos que el residuo fosforilado se encuentre incluido en el epítopo que el anticuerpo reconozca.
- Adición de una cisteína al extremo N-terminal: Esto aplica a la obtención de cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal, independientemente de que sea o no fosfoespecífico, pero lo incluimos aquí por tratarse de un factor clave para la posterior conjugación a un carrier (p.e. KLH, BSA) que le confiera inmunogenicidad, así como para la unión a la columna de afinidad en el paso de purificación.
2.- La purificación
La inmunización de un animal con un fosfopéptido, puede dar lugar a tres tipos de anticuerpos:
- Anticuerpos fosfoespecíficos (reconocen la forma fosforilada del péptido/proteína, pero no reaccionan con su forma no fosforilada).
- Anticuerpos específicos frente al péptido/proteína no fosforilada (puede ocurrir si las fosfatasas del animal inmunizado desfosforilan el péptido conjugado que se utiliza en la inmunización).
- Anticuerpos inespecíficos, que reconocen tanto la forma fosforilada como la no fosforilada del péptido/proteína, es decir, reconocen un epítopo que no incluye el residuo fosforilado.
Dicho esto, la manera de aislar los anticuerpos fosfoespecíficos de interés, pasaría por varios pasos de purificación por afinidad que se llevan a cabo de manera secuencial:
1º) Columna de afinidad revestida con el fosfopéptido: al hacer pasar por ella la fracción IgG, descartaremos los anticuerpos específicos de la forma no fosforilada de la proteína, junto con el resto de Inmunoglobulinas no específicas que pueda haber en la muestra. Los anticuerpos que han quedado unidos a la columna (los fosfoespecíficos y los que reconocen tanto la forma fosforilada como la no fosforilada), se eluyen y esta fracción se pasaría por una segunda columna de afinidad.
2º) Columna de afinidad revestida con el péptido no fosforilado: De la fracción eluída, solamente los anticuerpos que reconozcan ambas formas del péptido se unirán a la columna, recogiéndose, ahora sí, únicamente los anticuerpos fosfoespecíficos.
¿En qué técnicas pueden aplicarse los anticuerpos fosfoespecíficos?
Existen diversos métodos para el estudio de la fosforilación de las proteínas, siendo los anticuerpos fosfoespecíficos una herramienta imprescindible en muchos de ellos:
- Western Blot: Tras la separación de la muestra por SDS-PAGE y la siguiente tranferencia a la membrana, pueden emplearse anticuerpos fosfoespecíficos para estudiar la proteína de interés. En este caso conviene utilizar como control de carga interno un anticuerpo que reconozca la proteína de interés tanto en su forma fosforilada como no fosforilada.
- ELISA: Se puede utilizar un anticuerpo que reconozca tanto la forma fosforilada como la no fosforilada de la proteína como anticuerpo de captura, y un anticuerpo fosfoespecífico como anticuerpo de detección. A la hora de estudiar la fosforilación de las proteínas, el inmunoensayo ELISA presenta varias ventajas frente a técnicas tradicionales de inmunoblot:
- Los resultados pueden cuantificarse de manera sencilla mediante el uso estándares calibrados.
- Al utilizar dos anticuerpos específicos para la proteína de interés de manera simultánea en un ensayo tipo sándwich, la especificidad es mucho mayor.
- La alta sensibilidad de este tipo de ensayos permite el uso de menores volúmenes de muestra y la detección de proteínas poco abundantes.
- El formato de las placas con micropocillos permite un mayor rendimiento que el tradicional Western Blot.
- ELISA sobre células completas: Las células se estimulan, se fijan y se bloquean en el mismo pocillo. Los anticuerpos fosfoespecíficos permitirán en este caso la evaluación del estado de las fosforilaciones mediante detección fluorométrica o colorimétrica.
- Citometría de flujo/ Inmunocitoquímica / Inmunohistoquímica: En estos casos es necesario prestar especial interés a la alta afinidad y especificidad de los anticuerpos, pasos de bloqueo, controles y titulación de los anticuerpos para evitar resultados ambiguos debidos a uniones no específicas.
- Espectrometría de masas: Existen algunas dificultades inherentes al analizar fosfoproteínas mediante espectrometría de masas. Por un lado, las señales de los fosfopéptidos son generalmente más débiles, y por otro, puede ser difícil observar la señal de fosfoproteínas poco abundantes sobre el alto fondo de abundantes proteínas no fosforiladas. Es por ello que resulta imprescindible recurrir a estrategias de enriquecimiento, donde los anticuerpos fosfoespecíficos pueden resultar una opción de interés.
Evaluar la fosforilación de las proteínas es en muchos casos un elemento fundamental para comprender los factores intracelulares que subyacen a la actividad celular. Es crítico para los investigadores poder contar con métodos para medir la fosforilación de las proteínas y/o la actividad de las kinasas, y los anticuerpos fosfoespecíficos resultan ser una herramienta de calidad fundamental para llevar a cabo muchas de estas técnicas.
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