La producción de anticuerpos policlonales se lleva a cabo a partir de una mezcla de linfocitos B con afinidad por diferentes epítopos de un mismo antígeno. Y es precisamente esta característica, la capacidad de reconocer múltiples epítopos de un determinado antígeno, la que supone una ventaja frente a los anticuerpos monoclonales en algunos ensayos como es el caso de la inmunoprecipitación.
En esta entrada, repasaremos los factores clave que influyen en la producción de anticuerpos policlonales, incluyendo el antígeno y sus características, los protocolos de inmunización y el uso de adyuvantes, entre otros.
Claves para la producción de anticuerpos policlonales
A la hora de llevar a cabo la producción de anticuerpos policlonales, existen algunos pasos en el proceso de desarrollo que son críticos:
- La preparación del antígeno
- Selección de las especies animales
- Preparación del adyuvante
- Protocolo de inmunización
- Recolección de los anticuerpos
- Purificación de los anticuerpos policlonales
Veamos cada uno de estos puntos con más detalle:
1.- Preparación del antígeno
Antes de comenzar la producción de anticuerpos policlonales, es importante evaluar las características de antígeno en cuanto a cantidad y calidad, así como su preparación. Los tres factores principales a tener en cuenta son:
- Cantidad
La cantidad de antígeno inyectada al animal está directamente relacionada con la respuesta inmune que se va a desencadenar. Cantidades demasiado altas o demasiado bajas de antígeno pueden inducir fenómenos de supresión, sensibilización, tolerancia, etc.
Las cantidades habituales para la inmunización oscilan entre microgramos y miligramos, dependiendo del animal a inmunizar, la vía de administración, el calendario de inmunización y las características propias de cada antígeno particular.
- Pureza
La pureza del antígeno incide directamente en la especificidad de la respuesta inmune, ya que incluso las pequeñas impurezas pueden resultar inmunodominantes dando lugar a anticuerpos más activos frente a las impurezas que frente al antígeno de interés.
Por lo tanto, cuanto mayor sea la pureza del antígeno, más específicos serán los anticuerpos policlonales que se generen.
- Toxicidad
Es muy importante asegurarse de que la preparación que contiene el antígeno no contenga sustancias tóxicas como endotoxinas, residuos químicos, niveles de pH extremos, etc. Este tipo de contaminantes puede influir negativamente tanto en el bienestar animal como en los resultados inmunológicos.
Para terminar este apartado, os recordamos esta entrada anterior con algunas Claves para obtener buenos anticuerpos: el antígeno
2.- Selección de las especies animales
Para seleccionar la especie animal más adecuada para la producción de anticuerpos policlonales, conviene tener en cuenta tres factores:
- La cantidad de anticuerpo necesaria y la facilidad de sangrado de los animales
La especie más comúnmente utilizada para la producción de anticuerpos policlonales es el conejo, debido a que es un animal de fácil manejo y produce anticuerpos con alta afinidad y alta titulación.
Cuando se requieren cantidades mayores de anticuerpo, se suele recurrir a animales como la oveja o la cabra, o las gallinas (Recuerda este post sobre 5 razones para utilizar anticuerpos de gallina).
- La distancia filogenética entre el antígeno y la especie animal
La selección del animal en que se lleva a cabo la producción de anticuerpos policlonales está también influenciada por la especie animal de la que proviene el antígeno de interés. Cuanta mayor distancia filogenética haya entre ambas especies, mejor será la respuesta inmune que se despierte.
- La aplicación o técnica en la que se pretende usar el anticuerpo policlonal
Es importante también prestar atención a la aplicación final del anticuerpo que se quiere generar, ya que en algunos casos podría influir en la selección de la especie animal. Esto resulta especialmente importante en aquellos ensayos donde se vaya a hacer uso de un anticuerpo secundario, ya que ambos deberán ser generados en especies distintas.
Para terminar este apartado, os dejamos esta entrada anterior sobre Especies para la producción de anticuerpos, ¿cuál es mejor?
3.- Preparación del adyuvante
Los adyuvantes son mezclas de sustancias que se utilizan para estimular y amplificar la respuesta inmune. Por un lado, posibilitan la producción de anticuerpos policlonales a partir de antígenos poco inmunogénicos, y por otro, permiten administrar menores dosis de antígeno a los animales.
Existes multitud de adyuvantes utilizados para este fin, aunque los de uso más frecuente son el Adyuvante completo de Freund (FCA), el Adyuvante incompleto de Freund (FIA) y las sales de aluminio.
A la hora de preparar la mezcla adyuvante-antígeno, conviene recordar que hay que hacerlo en condiciones de asepsia para evitar contaminaciones, y monitorizar la estabilidad y la calidad de la emulsión.
4.- Protocolo de inmunización
La vía de administración del antígeno depende de la especie animal y de las características del antígeno y del adyuvante.
Las vías de administración más frecuentes son:
- Subcutánea (s.c.): Es la vía de administración más frecuente, y admite volúmenes de administración relativamente altos.
- Intramuscular (i.m.): Presenta la ventaja de que la absorción es más rápida. Sin embargo, resulta más dolorosa para el animal y puede llegar a dañar el nervio ciático.
- Intraperitoneal (i.p.): Admite volúmenes de administración relativamente altos, pero existe riesgo de shock anafiláctico. Esta vía no está recomendada en caso de animales de mayor tamaño como conejos, ovejas, cabras, etc.
- Intravenosa (i.v.): Presenta la ventaja de que la distribución del antígeno se lleva a cabo de manera muy rápida, pero también se incrementa el riesgo de shock anafiláctico.
- Intradérmica (i.d.): Aumenta la eficiencia en cuanto a procesamiento del antígeno, aunque resulta más dolorosa para los animales. Esta vía no se recomienda en el caso de pequeños roedores como ratas y ratones.
En cuanto al volumen de inyección, siempre hay que optar por el menor volumen capaz de despertar la respuesta inmune. Esto variará en función de las características del antígeno, la especie animal y la vía de administración.
5.- Recolección de los anticuerpos
En el caso de los mamíferos, pueden programarse una serie de sangrados durante el calendario de inmunización, con el fin de evaluar la respuesta inmune del animal y la producción de anticuerpos policlonales.
El volumen de sangrado no debería superar en ningún caso el 10% del volumen total de sangre circulante, y entre uno y otro sangrado debe respetarse un periodo de reposo de unas 3 o 4 semanas.
6.- Purificación de los anticuerpos policlonales
Una vez obtenido el antisuero, este puede contener restos celulares o inmunoglobulinas no específicas, entre otros, que pueden condicionar el correcto funcionamiento de los anticuerpos policlonales. Por ello es fundamental realizar un proceso de purificación.
Esta purificación puede llevarse a cabo mediante cromatografía de afinidad por proteína A o G, o en el caso de querer eliminar más ruido de fondo por uniones inespecíficas, se puede realizar una purificación por afinidad con el antígeno, aislando así los anticuerpos policlonales monoespecíficos.
Para terminar, os recordamos esta entrada anterior sobre Métodos de purificación de anticuerpos.
Esperamos que estas claves para la producción de anticuerpos policlonales os hayan resultado de interés. Y recordad que si queréis desarrollar vuestro proyecto de producción de anticuerpos policlonales con nosotros, podéis consultarnos sin compromiso.
