Las proteínas necesitan unas condiciones específicas para mantener sus características conformacionales, de estabilidad y actividad. Las condiciones desfavorables o los cambios bruscos en el entorno nativo de la proteína pueden llevar a que estas se degraden, se desnaturalicen o precipiten.
En esta entrada repasaremos los factores que influyen en la estabilidad de las proteínas, así como algunas pautas para saber cómo almacenar las proteínas de manera óptima, evitando así su degradación.
Factores que influyen en la estabilidad de las proteínas
1.- Buffers: el pH de la solución que contiene la proteína juega un papel fundamental en su estabilidad.
2.- Ambiente reductor: muchas proteínas contienen cisteínas con grupos tiol libres, que en caso de oxidarse pueden generar la pérdida de actividad biológica de la proteína.
3.- Contaminación por metales iónicos: para evitar la contaminación por metales iónicos, puede añadirse un agente quelante al buffer (p.e. EDTA), excepto en aquellos casos en los que la actividad de la proteína requiera la presencia de iones metálicos divalentes.
4.- Hidrofobicidad: en el caso de las proteínas menos solubles, como las proteínas de membrana, se pueden añadir aditivos para facilitar la disolución y evitar la degradación.
5.- Proteasas: pueden dar lugar a la precipitación de la proteína y/o a la pérdida de funcionalidad.
7.- Temperatura: la temperatura influye en el crecimiento bacteriano y en la actividad de proteasas y otros agentes degradantes, por lo que es otro de los factores que influye directamente en la estabilidad de las proteínas.
Cómo almacenar las proteínas para evitar su degradación
Cuando surge la necesidad de almacenar una proteína concreta durante un periodo determinado, es necesario asegurarse de que tanto su integridad estructural como su actividad no se vean alteradas con el tiempo. Las condiciones óptimas para el almacenamiento de cada proteína pueden variar en cada caso concreto, pero existen una serie de recomendaciones generales que nos ayudarán a saber cómo almacenar las proteínas para evitar su degradación.
1.- TEMPERATURA
En general, las proteínas pueden almacenarse bajo 4 condiciones de temperatura:
- Liofilizadas a temperatura ambiente
- Refrigeradas a 4ºC
- Congeladas a -20ºC
- Ultracongeladas a -80ºC o en nitrógeno líquido
Veamos las ventajas e inconvenientes en cada caso:
- Liofilizadas a temperatura ambiente
- Permite el almacenamiento a largo plazo (años)
- Ventajas: Evita la degradación química y por hidrólisis de la proteína, así como la contaminación bacteriana, y facilita el transporte y el almacenamiento al ser estable a temperatura ambiente.
- Inconvenientes: La liofilización requiere equipamiento específico, no todas las proteínas pueden ser liofilizadas, y en el momento de su utilización requieren un paso adicional de reconstitución.
- Refrigeradas a 4ºC, en solución
- Permite el almacenamiento a corto plazo (2/3 semanas)
- Ventajas: Se evitan los ciclos de congelación-descongelación y la muestra está lista para ser usada en el momento del ensayo.
- Inconvenientes: Es más propenso a la degradación por contaminación bacteriana, proteólisis y/o oxidación.
- Congeladas a -20ºC, en solución con crioprotectores
- Permite el almacenamiento a medio plazo (1 año)
- Ventajas: Resiste a la contaminación bacteriana y a la degradación por proteasas y oxidación.
- Inconvenientes: Al tener que añadir crioprotectores, se diluye la concentración total de la proteína.
- Ultracongeladas a -80ºC o en nitrógeno líquido
- Permite el almacenamiento a largo plazo (años)
- Ventajas: Se evita la contaminación, y no es necesario añadir aditivos como crioprotectores o antibacterianos.
- Inconvenientes: Los ciclos repetidos de congelación-descongelación pueden degradar la proteína, por lo que resulta fundamental alicuotar la muestra antes de ultracongelarla. (Recuerda esta entrada sobre Ciclos de congelación-descongelación y degradación de muestras)
2.- CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA
Las proteínas diluidas (por debajo de 1mg/mL), son más propensas a sufrir degradación, por lo que siempre se recomienda almacenar las proteínas a la concentración más alta posible.
En caso de que la proteína de interés se encuentre a una concentración muy baja y no haya posibilidad de concentrarla, pueden añadirse proteínas auxiliares como BSA para proteger de posibles degradaciones.
3.- ADITIVOS
Existen varios aditivos que pueden añadirse a las proteínas en solución para incrementar su estabilidad, como por ejemplo:
- Crioprotectores como glicerol o etilenglicol que previenen la formación de cristales al congelar las proteínas, evitando que estos degraden su estructura.
- Inhibidores de proteasas para prevenir la proteólisis de las proteínas.
- Agentes antimicrobianos (p.e. azida sódica) para inhibir el crecimiento bacteriano.
- Agentes quelantes para evitar la oxidación de los grupos tiol inducida por iones metálicos.
- Agentes reductores como el DTT o el 2-mercaptoetanol para evitar la oxidación de las cisteínas.
Para terminar esta entrada sobre cómo almacenar las proteínas para evitar su degradación, os dejamos esta selección de posts relacionados:
