La predominancia de proteínas de alta abundancia en las muestras biológicas, a menudo complica las labores para analizar y detectar proteínas de poca abundancia conocidas como LAPs (low abundance proteins). En el caso del plasma por ejemplo, el 99% del total de su contenido proteínico lo componen tan solo 22 proteínas mayoritarias, mientras que el 1% restante corresponde a cientos de proteínas que se expresan en bajas cantidades.
Para poder detectar proteínas de baja abundancia en una muestra biológica se pueden utilizar métodos estándar, pero estos requieren pasos previos de optimización y amplificación de la señal.
En esta entrada resumimos los principales métodos para detectar proteínas de baja abundancia en muestras biológicas.
Métodos para detectar proteínas de baja abundancia
Antes de proceder al análisis de las proteínas de baja abundancia, es preciso realizar un proceso de enriquecimiento de la muestra mediante la depleción de las proteínas altamente abundantes en la misma, para incrementar así la señal específica de las proteínas de baja abundancia facilitando su detección.
Existen varios métodos para enriquecer estas muestras, entre los que cabe destacar:
- Tratamiento con colagenasa (puede llegar a duplicar la señal de detección de proteínas de baja abundancia)
- Extracción de isopropanol con electroforesis en gel de poliacrilamida
- Separación con polietilenglicol y depleción basada en inmunoafinidad (este método utiliza anticuerpos IgY y puede aumentar la sensibilidad hasta 3 veces)
- Precipitación con sulfato de protamina combinado con Western Blot (método sencillo y de bajo coste para deplecionar proteínas abundantes)
- Nanopartículas magnéticas
- Métodos de inmunodepleción basados en reactivos de captura
- Partición de inmunoafinidad
- Cromatografía de heparina (puede incrementar la señal de detección en más de un 20%)
Una vez enriquecida la muestra, es preciso optimizar el método de detección que se vaya a utilizar para detectar proteínas de baja abundancia:
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas con aumento de la señal es uno de los métodos más utilizados para detectar proteínas de baja abundancia en varios tipos de muestras, especialmente en suero, tejido adiposo, hueso y tendones.
Este análisis se puede mejorar utilizando reactivos de captura por afinidad frente a la proteína de interés, ya que esto permite incrementar la concentración de la misma.
Western Blot
El western Blot, convenientemente optimizado, es un método muy efectivo para detectar proteínas de baja abundancia. La optimización de esta técnica pasa por:
- Selección del buffer de lisis adecuado
- Precipitación de las proteínas
- Optimización de la electroforesis en gel
- Optimización de la concentración del anticuerpo primario
- Optimización de la detección de la señal
ELISA
Aunque los ensayos ELISA estándar no son lo suficientemente sensibles para detectar proteínas de baja abundancia, combinando esta técnica con un ensayo de ligadura de proximidad (PLA) se consigue incrementar significativamente la especificidad al detectar la proteína de interés de manera simultánea mediante numerosas sondas.
Este método se ha utilizado para la detección de biomarcadores de enfermedades neurodegenerativas e inflamatorias.
Resonancia magnética nuclear
Otro de los métodos más efectivos para detectar proteínas de baja abundancia es la resonancia magnética nuclear de alta resolución, que ofrece una alta sensibilidad y selectividad sin necesidad de un procedimiento de aislamiento previo.
Este método se ha utilizado para el análisis de biomarcadores relacionados con el Alzheimer como la proteína β-amiloide.
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