El sistema CRISPR ha revolucionado en los últimos años el campo de la ingeniería genética, permitiendo alterar los genes de manera sencilla. El principio básico de CRISPR se basa en cortar el DNA objeto o diana en un punto específico, utilizando una enzima nicasa (Cas) que es guiada por un fragmento de RNA llamado guía (gRNA). Esta guía, se encarga de dirigir a la enzima hasta el punto donde debe cortar.
Sin embargo, existen diversos retos a la hora de elegir los componentes necesarios de este sistema, gRNA y Cas. En este artículo trataremos los conceptos a tener en cuenta a la hora de diseñar y seleccionar las guías de RNA más adecuadas para cada experimento.
En Abyntek ponemos a tu disposición esta tecnología revolucionaria de manera sencilla y acompañándote durante todo el proceso.
Las guías de RNA son secuencias de 20 nucleótidos, complementarias a la secuencia del DNA diana. La función de estos oligonucleótidos es detectar su secuencia complementaria en el DNA diana y unirse a él. El objetivo de la unión del gRNA al DNA diana es dirigir a Cas al sitio de corte deseado.
Para que esto ocurra, Cas a su vez ha de reconocer una secuencia de 3 nucleótidos llamada PAM (protospacer adjacent motifs), que se encuentra adyacente a la secuencia diana. Esta secuencia consta de 3 nucleótidos (5´-NGG-3´ en el Caso de Cas 9). Al reconocer esta secuencia, Cas 9 corta el DNA diana entre las posiciones 17 y 18 del gRNA.
Uno de los mayores retos que se plantean es que el sistema CRISPR sea capaz de identificar los lugares donde se desea cortar de manera eficiente, evitando que se produzcan cortes en otros lugares diferentes a la diana, comúnmente llamados off-targets. Por lo tanto, la eficiencia del corte no solo depende de la actividad de la enzima Cas 9, sino también de la eficiencia y especificidad de las guías para el reconocimiento del DNA diana.
La guía de RNA perfecta debería unirse de manera altamente eficiente a la secuencia diana específicamente, minimizando así las posibles uniones a otras secuencias off-target. A priori, puede parecer una tarea fácil, pero para mantener el balance entre eficiencia y especificidad hay que tener ciertos parámetros en cuenta a la hora de diseñar las guías.
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¿QUÉ SE DEBE TENER EN CUENTA A LA HORA DE DISEÑAR LAS GUÍAS?
Referente al gRNA
Secuencia del gRNA
La técnica para la obtención de las guías es comúnmente la expresión y clonación de las secuencias. Así, la eficiencia en la síntesis y transcripción posterior afectará a la actividad CRISPR. Además, ciertos motivos dentro de esta secuencia pueden producir interferencias.
- Secuencias que comienzan por 5´ AG pueden generar errores, debido a la heterogeneidad en la transcripción utilizando polimerasa T7.
- La repetición de bases, también puede suponer un problema en la síntesis. AAAAA, CCCCC, GGGG y UUUU disminuyen la eficiencia de corte.
- La secuencia GGGG específicamente se relaciona con una actividad CRISPR más baja, además por la tendencia a la formación de estructuras secundarias. Estas estructuras dificultan la unión.
- Las secuencias UUUU pueden asimismo interferir en la transcripción haciendo que la RNA polimerasa III termine según encuentra esta secuencia.
- La repetición de timinas (TT+Y, TT+YY) en 3´ también supone un problema, pudiendo generar una disminución considerable en la eficiencia de corte.
- En la misma posición 3´, el motivo GCC puede a su vez afectar a la eficiencia de corte de Cas 9.
- Longitud de la secuencia
Longitud de la secuencia
La longitud recomendada es 20 nucleótidos:
- Secuencias cortas, 17-18 nucleótidos, son más específicas, pero menos eficientes.
- Secuencias largas, más de 20 nucleótidos, son menos efectivas.
Composición Nucleotídica
La composición de nucleótidos también puede generar diferencias funcionales en el gRNA:
- Un alto número de Adeninas en las posiciones 9-16 puede aumentar la afinidad de la C Cas 9. Sin embargo, si esta zona está enriquecida en Uracilo o Guanina puede generar un gRNA menos funcional.
- Un 40-80% de GC se considera óptimo. En general, se favorece una mayor actividad si hay:
- GSs en las posiciones 4-5
- GCs en los 6 nucleótidos próximos a la secuencia PAM
Posición Específica de los Nucleótidos
Hay posiciones específicas que resultan críticas para la eficiencia del sistema CRISPR:
La secuencia de nucleótidos terminal (16-20) del gRNA, próxima a la secuencia PAM, es crucial para el correcto funcionamiento de 9. Esta región se conoce como “seed”.
- En las posiciones 19 y 20 son preferibles bases de purina, G o A, como últimos nucleótidos. Mientras que no se recomienda en absoluto una Citosina en la última posición.
- En las posiciones 16 y 18 es preferible Citosina, sobre todo en la 18, que se corresponde con el lugar de corte de 9. En este caso, no es nada recomendable que en estas posiciones haya Guanina.
Características Estructurales
A la hora de diseñar las guías es importante tener en cuenta la estructura secundaria, el auto plegamiento y la accesibilidad de los nucleótidos.
Lo nucleótidos más importantes en cuando a la estructura son los que se encuentran en las posiciones 18-20 y 51-53. Estas posiciones se corresponden con el final de la guía y la región scaffold del RNA. Son importantes porque la estructura secundaria del sgRNA consiste en un lazo, en el que las posiciones 18-20 se alinean emparejándose con la 51-53. Por lo tanto, para que el emparejamiento se produzca, las secuencias han de ser complementarias. Si este emparejamiento no se da correctamente la eficiencia disminuirá.
Consideraciones de la secuencia diana
Es importante considerar dónde se encuentra la secuencia diana. Se ha observado que la actividad del gRNA disminuye cuando la secuencia diana se encuentra cerca del extremo C-terminal. Si la mutación que queremos generar está cerca del final de la proteína, hay menor probabilidades de alterar su expresión.
¿CÓMO DISEÑAR GUÍAS DE MANERA SENCILLA?
Para superar todo lo comentado anteriormente, existen diversas herramientas online que permiten diseñar guías integrando algoritmos creados a partir del análisis de un gran volumen de datos de experimentos CRISPR. Algunos de estos son CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPR-GE, CRISPR-P, asCRISPR o SnapGene.
CHOPCHOP y CRISPOR
Son herramientas online gratuitas y de uso sencillo. Permiten el desarrollo de guías para diferentes tipos de experimentos, KO, KI y activación/represión génica.
Además tienen en cuenta diferentes modelos predictivos que el usuario puede utilizar para predecir la especificad y eficiencia del corte.
Con el fin de ofrecer un resultado más riguroso contemplan el tipo celular y diferentes secuencias PAM en función de Cas. Son compatibles con más de 200 genomas, y permiten diseñar guías en una región específica del gen. Asimismo, proporcionan secuencias para diseñar primers.
CRISPR-GE y CRISPR-P
Son Softwares para el diseño de experimentos CRISPR en plantas.
asCRISPR
Está diseñado para experimentos que necesitan discernir entre elementos del genoma de alelos específicos yestá específicamente creado para determinar variantes de un único nucleótido (SNV).
Éstas son solo algunas de las muchas opciones disponibles, ya que cada día se desarrollan nuevos algoritmos y sistemas con el fin de mejorar y afinar las herramientas disponibles hasta el momento.
En Abyntek contamos con un extenso catálogo y un servicio a medida con productos validados por el Broad Institute MIT y Harvard donde nuestros expertos te asesorarán y guiarán en todo momento para impulsar tu investigación a otro nivel.
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