Muchas veces nos preguntamos cómo elegir el buffer de purificación de proteínas adecuado para obtener los mejores resultados en nuestro experimento. El uso de un buffer adecuado durante el proceso de purificación de proteínas es importante ya que:
- Mejora la estabilidad de las proteínas: durante el proceso de purificación, las proteínas sufren diferentes tratamientos que pueden alterar sus propiedades.
- Facilitan la separación de las proteínas que se quieren purificar de otros componentes celulares no solubles.
- Protegen la pureza de las proteínas manteniéndolas en un contexto estable.
Un buffer de purificación de proteínas es, en este sentido, aquel que resiste los cambios en el pH cuando se le agregan pequeñas cantidades de un ácido o un álcali.
Para estas funciones, las propiedades adecuadas que debería tener un buffer de purificación de proteínas, según algunos expertos, son las siguientes:
- Agua soluble.
- No penetrable en las membranas biológicas.
- pKa entre 6 y 8.
- Tener un efecto mínimo sobre las reacciones bioquímicas.
- Químicamente estable.
- No absorber la luz ultravioleta.
- Fácil de purificar.
Cómo elegir el buffer de purificación de proteínas: factores clave
El pH
En primer lugar, hay que determinar el pH en el que se debe trabajar. Muchos experimentos se llevan a cabo imitando las condiciones biológicas (pH 7,4). Dependiendo del tipo de ensayo que vayáis a realizar, tendréis que tener en cuenta la carga de la proteína.
Cuando el buffer del pH es igual al pI (punto isoeléctrico), la proteína no tiene carga. Ajustar el pH por debajo o por encima de la proteína pI induce una carga positiva cuando pH<pI y una carga negativa cuando pH>pI.
Si se quiere realizar, por ejemplo, una purificación de intercambio iónico, la proteína deberá estar cargada para poder quedar retenida en la columna, para su posterior purificación.
Agentes reductores
Protegen frente al daño oxidativo. Este daño puede provocar la agregación de las proteínas y, por tanto, que no se realice una purificación adecuada. Para evitar esto, existen una serie de agentes reductores: DTT, TCEP y BME.
Estos agentes reductores deben tener una concentración mayor que la concentración de la proteína que se quiera purificar.
Inhibidores de proteasas
Inhiben la degradación de proteínas mediante proteasas endógenas. Alguno de ellos puede ser: EDTA, PMSF, benzamidina, etc.
Elementos estabilizadores
Existen una serie de elementos que ayudan a aumentar la estabilidad, protegiendo las interacciones iónicas, y a aumentar la solubilidad de las proteínas, como detergentes, sulfatos o aminoácidos, en pequeñas cantidades.
Existen, además, otro tipo de elementos que funcionan como estabilizadores iónicos, como las sales. Este tipo de sales como el NaCl, ayudan también a mejorar la solubilidad de las proteínas.
Por lo que, para saber cómo elegir el buffer de purificación de proteínas, es necesario tener en cuenta todos estos factores y elegir el que mejor se adapte a vuestras proteínas.
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