La tecnología CRISPR ha contribuido en los últimos años a la revolución en el campo de la ingeniería genética, permitiendo modificar los genes de manera sencilla. El sistema CRISPR está compuesto por 2 elementos claves: la guía de RNA que se une al ADN diana para dirigir al segundo componente, Cas9, que corta el ADN diana reconociendo una secuencia llamada PAM.

Elegir los componentes del sistema CRISPR es todo un reto. En otros artículos del blog hemos tratado sobre este tema y todo lo que hay que tener en cuenta para diseñar las guías de RNA. Puede parecer una tarea complicada, pero siguiendo unos pocos consejos y utilizando las herramientas online existentes, el éxito está casi asegurado.

En esta ocasión hablaremos de cómo minimizar y detectar los efectos off-target, que se producen cuando la guía se une a otras partes del ADN diana, diferentes a la secuencia para la que fueron diseñadas. Esta acción hace que CAS9 corte el ADN en varios u otros puntos, lo que generará que se introduzcan otras mutaciones distintas a las previstas.

Resulta obvio que un buen diseño de las guías de RNA es imprescindible para minimizar los efectos off-target.

Por esto, la detección de estos efectos no deseados es necesaria. Aunque la tecnología CRISPR ha evolucionado y crecido mucho en los últimos años, aún no se conoce completamente y aún quedan muchos aspectos que investigar y descubrir.

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La tarea de detección de off-targets ha de desarrollarse en dos pasos:

1. Predicción de los posibles efectos in silico, utilizando herramientas computacionales. Son conocidas como herramientas sesgadas ya que la información que dan son predicciones que pueden o no ajustarse a la realidad.
2. Experimentación posterior utilizando métodos no sesgados. Esto permite detectar los lugares de corte, fuera de la diana, en todo el genoma.

Herramientas computacionales

Herramientas tradicionales basadas en alineamiento

Al principio se pensó que las herramientas tradicionales existentes de alineamiento (short sequence alignment) se podían utilizar con este objetivo. Así, el sitio diana es realineado con el genoma de referencia para poder identificar lugares similares que pudieran ser inadvertidamente el objetivo de CAS9. Algunas de las herramientas que permiten llevar a cabo este tipo de alineamientos son BWA o Bowtie, que funcionan mejor que la tradicional BLAST, aunque esta también se ha utilizado en sus orígenes.

Sin embargo, estas herramientas reacondicionadas o actualizadas para ser utilizadas en experimentos CRISPR no suponen una solución al problema. La búsqueda de potenciales lugares off-target requiere de la identificación de pequeñas secuencias correspondientes a 20 pb + la secuencia PAM, lo cual puede conllevar ciertos mismatches. Estas herramientas tradicionales no están preparadas para detectar secuencias tan pequeñas y divergentes. Bowtie y BWA permiten 3 y 5 mismatches respectivamente, lo cual puede hacer que más off-targets pasen desapercibidos.

Si se hace una comparación de los métodos tradicionales frente a los diseñados específicamente para el sistema CRISPR-CAS9, estos métodos tradicionales no solo pierden off-targets de mismatches grandes, sino que también algunos con uno solo. Lo que sugiere que estas herramientas no son lo bastante específicas como para utilizarlas con este nuevo propósito.

Herramientas diseñadas específicamente para CRISPR basadas en alineamiento

Para identificar de manera precisa los potenciales off-targets se han implementado nuevos métodos de alineamiento específicamente creados para el sistema CRISPR. En este tipo de métodos, dos alineadores bidireccionales casan primero con una porción pequeña de la secuencia, llamada seed. Cada alineador trabajan extendiendo esta región seed inicial en ambas direcciones. Esta forma de trabajo simultáneo, permite identificar todos los posibles off-targets.

Hay que tener en cuenta que no todos los presuntos off-targets son funcionales, pudiendose generar falsos positivos. Para reducir el número de predicciones de falsos positivos, estos modelos predictivos limitan potenciales off-targets maximizando el número de mismatches. Sin embargo, también se ha observado, que los off-targets reales pueden ser diferentes a los que han sido predichos mediante las herramientas, lo que significa que pueden resultar en falsos negativos. Por lo tanto, un buen balance de los falsos positivos y negativos es necesario. Para compensar esto, se han desarrollado algoritmos de clasificación, pudiendo filtrar los falsos positivos.

Algunos de los programas más usados en experimentos CRISPR que incorporan todos estos avances son CRISPOR o Cas-OFFinder. La última, es considerada la herramienta universal de detección de off-targets.

Sin embargo, aunque estas herramientas son muy útiles se basan en predicciones. La manera más recomendable de proceder a la hora de diseñar el experimento CRISPR es utilizar alguno de estos programas para analizar los posibles off-targets in silico y después confirmar si las predicciones se cumplen.

Herramientas in vitro

Cabe pensar que la mejor técnica para comprobar los cortes off-targets es la secuenciación completa del genoma (WGS). Esta técnica permitiría detectar la mutación que se ha introducido y cuantificarla. Por lo tanto, saber exactamente qué mutación se ha introducido, dónde, y además de si se han mutado otras zonas off-target.

Sin embargo, este método también presenta inconvenientes, por lo que se han desarrollado técnicas que permiten utilizar esta metodología incluyendo mejoras, como digenome-seq, site-seq, o circle-seq. Estas técnicas, como todas, tienen sus ventajas y desventajas, así como recomendaciones en función de la aplicación. Digenome-seq y site-seq se basa en la digestión del genoma de las células con el complejo ribonucleoproteina (RNP), permitiendo así maximizar la detección de los off-targets que son después detectados mediante secuenciación masiva (WGS) como fragmentos con terminaciones 5` idénticas.

Por otro lado, la técnica circle-seq, fue desarrollada para reducir el ruido de fondo de las técnicas anteriores. Para ello, se circulariza el ADN primero, para después linealizarlo de nuevo. El siguiente paso es secuenciar el ADN lineal, lo que elimina prácticamente la detección de DBS previos.

Herramientas in vivo

Las herramientas in vivo se han diseñado para algunos tipos de experimentos en los que los resultados de los off-target in vitro no se cumplen in vivo.

La primera herramienta que se desarrolló con este objetivo fue IDVL, basada en vectores lentivirales IDLV (integrase defective lentiviral vectors). El vector lentiviral se transfiere simultáneamente, junto con el sistema CRISPR, el cual se integra al producirse la corrección de la mutación mediante DBS. Posteriormente, el ADN es cortado y los fragmentos religados mediante un conector. Para determinar el efecto off-target se realiza una PCR que detecta la distribución de IDLVs. Esta técnica, es muy efectiva en células difíciles de transfectar, como células primarias.

A partir de esta metodología se han desarrollado otras herramientas, como BLESS o GUIDE-Seq, que tratan de suplir las limitaciones que han podido surgir. Una de las técnicas más robustas y sensitivas in vivo es LAM-HTGTS. Esta técnica permite detectar traslocaciones cromosómicas en cultivos de células de mamífero mediante la unión de los DSBs producidos por las endonucleasas. Sin embargo, las traslocaciones debidas a DSBs son raras.

Existen otras técnicas in vivo con sus ventajas y desventajas, como DISCOVER-Seq, VIVO, o la última en ser desarrollada, GOTI. Esta última, permite detectar off-targets en una población celular proveniente de un solo blastómero. De esta manera, se pueden detectar sitios off-target en un embrión de ratón en los primeros estadios del desarrollo.

Todas las técnicas aquí descritas son solo algunos ejemplos de las que actualmente existen. Todas tienen sus ventajas, desventajas y aplicaciones recomendadas. Cada día se estudian más aspectos de la tecnología CRISPR y con ello surgen nuevas técnicas que mejoran las limitaciones de la anterior.

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Tips para minimizar off-targets

Existen ciertas reglas a la hora de diseñar el experimento y elegir los componentes del sistema para intentar minimizar los efectos off-target.

Diseño de guías

Las herramientas computacionales diseñadas para CRISPR, como CHOPCHOP y CRISPOR tienen en cuenta lo siguiente a la hora de ofrecer las posibilidades:

• La posición de los missmatches afecta a los efectos off-target.
• Los potenciales off-target no deben estar seguidos de las secuencias PAM 5´NGG o 5´NAG. Los missmatches cercanos a las secuencias PAM son peor tolerados.
• El número mínimo de mismatches entre el sgRNA y los potenciales off-target debe estar limitado a 3 nucleótidos.
• Mismatches en el extremo 5´del sgRNA son mejor tolerados en las primeras 8-14 pares de bases.
• Pueden ocurrir off-targets incluso con 6 mismatches entre el gRNA y el ADN off-target.
• Ajustar el ratio Cas9:gRNA a introducir en la célula mejora la aparición de off-targets (Hsu 2013).
• Utilizar sgRNA truncados

Sistemas de delivery

La introducción del sistema CRISPR en la célula mediante RNP reduce los efectos off-targets en comparación con la utilización de plásmidos.

Este sistema, utiliza lipofectamina y nanopartículas cargadas como sistema de delivery. El sistema RNP se une al ADN y lo corta directamente después de su entrada en la célula. Posteriormente, es degradado de manera muy rápida, por lo que al reducir el tiempo de vida se reduce también el tiempo de exposición y la probabilidad de corte en otros lugares diferentes a la diana. Contrariamente, en los sistemas plasmídicos, el RNA ha de ser transportado al núcleo y posteriormente el mRNA traslocado para su traducción. Entonces la Cas9 y el gRNA expresados, han de ser devueltos al núcleo para poder editar el ADN diana. Este proceso suele durar unas 24 horas. Además, los plásmidos en sí, son capaces de sobrevivir días en la célula. Todo esto, hace que, al permanecer más tiempo en contacto, aumente la probabilidad de producirse más off-targets.

Elección de Cas

La enzima nicasa más utilizada en los experimentos CRISPR es la Cas 9 de Streptococcus pyogenes (spCas9). Sin embargo, ha sido modificada para intentar reducir los efectos off-target. Una de ellas es la eSpCas9 (enhanced specifity). Algunos de los aminoácidos de esta enzima, no hacen contacto específico con el ADN diana, por lo que se mutaron para reducir el número de mismatches tolerables. Esta renovada eSpCas9 se denominó SpCas9-HF1 o de alta fidelidad. Sin embargo, pronto se observó que estas dos nuevas nicasas, aunque eran más específicas que la anterior, reducían en algunos genes el efecto en el ADN diana (on-target). A partir de aquí, otras mejoras se fueron añadiendo a esta enzima, hasta dar con la última, llamada HiFi Cas9. Esta última enzima, posee una mutación puntual que incrementa la actividad en el sitio diana, manteniendo una muy baja, prácticamente indetectable, actividad off-target.

También existen enzimas Cas procedentes de otros microorganismos con otras características diferentes. Por ejemplo, SaCas9, procedente de S. aureus. Esta nicasa está codificada por un gen más pequeño, lo que permite su uso junto con un vector adenoasociado (AVV) para aplicaciones in o ex vivo más eficientes. Además, es capaz de reconocer secuencias de PAM más largas, lo cual parece aumentar la especificidad.

Así, se conoce de la existencia de enzimas Cas9 procedentes de otros tantos microorganismos, con sus ventajas asociadas en función de sus características.

Bibliografía recomendada para más información acerca de estas técnicas:

Doi: 10.3389/fgeed.2021.673022

Doi: 10.3390/cells9071608

Doi: 10.3389/fcell.2021.718466