La citometría de flujo (FC) es una gran herramienta para analizar las propiedades físico-químicas de las células o de sus componentes. Para lograr unos buenos resultados, es necesario planificar los ensayos adecuadamente, prestando especial atención al diseño de los paneles policromáticos y optimizando así la sensibilidad del ensayo.
En este post os resumimos los pasos más críticos sobre cómo crear un panel de anticuerpos para citometría de flujo.
Cómo crear un panel de anticuerpos para citometría de flujo
1.- Establecer una hipótesis
Tras establecer una hipótesis biológica, deberemos hacernos algunas preguntas que nos permitirán planificar adecuadamente el experimento:
- ¿Qué población se quiere identificar?
- ¿Qué información se quiere extraer de los datos obtenidos?
- ¿Existen reactivos comerciales disponibles frente a las proteínas de interés o la posibilidad de conjugar los anticuerpos in-house? (Recuerda esta guía sobre la conjugación de anticuerpos)
2.- Analizar los fluorocromos
En primer lugar, es necesario asegurarse que el citómetro sea adecuado para los fluoróforos seleccionados.
Lo ideal es emparejar los fluorocromos más luminosos con los antígenos que se expresen en menor cantidad, y los más oscuros con los antígenos con altos niveles de expresión en la muestra.
3.- Familiarizarse con el citómetro
Es importante entender las capacidades del citómetro concreto que se va a utilizar. La mayoría de ellos tendrán al menos tres láseres que emitirán a distintas longitudes de onda, y además, pueden contar con filtros y/o detectores adicionales. En función de estos parámetros quedará definido el número de colores que pueden detectarse de forma simultánea.
4.- Utilizar un programa de construcción de paneles
Es crítico encontrar todos los pares antígeno-fluorocromo disponibles, para poder tener mayor probabilidad de elegir correctamente el que mejor se adecúe a nuestro experimento. Para ello, resultan de gran ayuda los programas diseñados para tal fin (por ejemplo, Fluorofinder o Chromocyte), que facilitan la búsqueda de estos reactivos.
5.- Proteger los fluoróforos combinados
A medida que se incrementa el número de colores en un panel, puede ser necesario recurrir a tándems de colorantes del tipo PE-Alexa Fluor o APC-Cy7, para incrementar así el rango de emisión de un determinado laser.
Estos conjugados son muy susceptibles de degradarse por efecto de la luz y la actividad biológica celular, dando como resultado la desunión de los conjugados, y por lo tanto, la emisión de fluorescencia a dos longitudes de onda distintas, lo que podría ocasionar falsos positivos.
6.- Optimizar el panel
Para optimizar y validar el panel de anticuerpos para citometría de flujo, será necesario ajustar los siguientes parámetros:
- Titulación adecuada de los anticuerpos, para asegurar que se utiliza la concentración óptima de los mismos.
- Optimizar el voltaje para cada uno de los fluorocromos.
- Optimizar el protocolo de tinción con el fin de bloquear las uniones inespecíficas.
El diseño de un panel de anticuerpos para citometría de flujo es un procedimiento complejo, que puede requerir largos periodos desde el planteamiento del experimento hasta su optimización. Esperamos que estos tips os sirvan para simplificar el proceso y acortar esos tiempos.
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