En el contexto de la actual pandemia de SARS-CoV-2, el diagnóstico del coronavirus mediante CRISPR se está postulando como una alternativa a los test serológicos y diagnóstico mediante kits de PCR que se emplean actualmente.
CRISPR es una tecnología muy conocida como herramienta de edición genómica, pero sus potenciales aplicaciones van mucho más allá.
En esta entrada os contamos cómo la tecnología CRISPR está siendo aprovechada por numerosos grupos de investigación para desarrollar sistemas de diagnóstico frente al Coronavirus.
Diagnóstico del Coronavirus mediante CRISPR
De forma muy sencilla, la tecnología CRISPR es un sistema formado por dos elementos principales: una nucleasa cuya función es cortar el DNA y un RNA guía que se encarga de identificar el punto exacto del genoma sobre el que la nucleasa debe actuar.
Tras la secuenciación del genoma de SARS-CoV-2 se han desarrollado varias técnicas adaptando la tecnología CRISPR a la detección del virus. A día de hoy, las dos aproximaciones que han conseguido mayor relevancia son las conocidas como SHERLOCK y DETECTR. Ambas tecnologías aprovechan la actividad de las endonucleasas guiadas por ARN, Cas12a y Cas13a respectivamente, para permitir la detección rápida de material genómico viral mediante fluorescencia.
SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)
Es una técnica que se desarrolló en el laboratorio de Feng Zhang del Instituto Broad en Cambridge, Massachusetts. Se basa en el uso de la enzima Cas13a que tiene la capacidad de cortar ARN (y no ADN, como realiza Cas9, utilizada de forma habitual para la técnica de CRISPR), y de activarse gracias a una pequeña guía de ARN específica que sea complementaria al ARN que se quiere cortar y degradar.
Además, esta enzima tiene la capacidad de degradar no solo el ARN complementario diana, sino todos los ARN que hay en el medio.
Como ya se conoce la secuencia del genoma del SARS-CoV-2, en presencia del fragmento de ARN que se pretende detectar, el ARN guía (diseñado para complementar el ARN diana) interacciona con el mismo y activa a Cas13a; entonces, la actividad RNAsa de Cas13a fragmenta las moléculas de ARN marcadas que liberan señales que pueden ser detectadas.
Dado que la fluorescencia no aparece hasta que comienza la degradación del ARN, y si no hay ARN complementario a la guía de ARN específica la degradación no comenzará, el sistema SHERLOCK representa un método muy específico y sensible.
En este caso, la prueba está dirigida a detectar el gen de la proteína S, que interviene en la entrada del virus a las células humanas, y el gen Orf1ab, que codifica una replicasa del virus.
DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)
DETECTR se desarrolló por primera vez en el laboratorio de Jennifer Doudna de la Universidad de California en Berkeley.
En este caso, la enzima utilizada es Cas12a, que funciona de manera similar a Cas13a, pero dirigida contra fragmentos de ADN. Dado que el Coronavirus es un virus de ARN, para poder realizar esta prueba, es necesario un paso previo de transformación del ARN del virus a ADN y posterior amplificación.
En la tecnología DETECTR, los genes del virus que se detectan son el gen N (que codifica la proteína N de la nucleocápside que compacta el ARN vírico) y el gen E (que codifica para una proteína de la envoltura del virus).
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL DIAGNÓSTICO DEL CORONAVIRUS MEDIANTE CRISPR
Los métodos basados en tecnología CRISPR supondrían grandes ventajas para el diagnóstico del Coronavirus frente a las técnicas actuales, entre las que cabe destacar:
- Mayor rapidez en la obtención de resultados
- Capacidad de multiplexado
- Requieren instrumental básico de laboratorio
- Reactivos diferentes a la PCR, lo que sortearía problemas de desabastecimiento en casos de pandemia.
En contrapartida, la principal desventaja con respecto a la PCR es que el diagnóstico del Coronavirus mediante CRISPR ofrece una menor sensibilidad, lo que podría incrementar el ratio de falsos negativos.
| DETECTR | SHERLOCK | RT-PCR | |
| Diana | Gen N y Gen E | Gen S y Gen Orf1ab | Gen N |
| Límite de detección | 10-50 copias/µl | 10-100 copias/µl | 1-3.16 copias/µl |
| Duración de la prueba | 40 minutos | 60 minutos | 120 minutos |
| Componentes prueba | RT-LAMP Cas12 Lateral Flow | RT-RPA IVT + Cas13 Lateral Flow | Primer Nucleótidos Transcriptasa Inversa |
| Instrumentación especializada | No | No | Sí |
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