Esta semana os traemos una guía rápida con consejos sencillos y concretos para solucionar problemas en ELISA de manera fácil.
No se obtiene coloración
- El protocolo no se ha seguido correctamente
- Comprobar que se han seguido todos los pasos y en el orden correcto
- Problemas con el conjugado y/o el sustrato
- Comprobar que se ha añadido el sustrato y que el conjugado utilizado es correcto
- Interacciones con azida sódica
- Evitar los buffers de lavado que la contengan
Baja intensidad de la señal
- Longitud de onda incorrecta
- Configurar la longitud de onda adecuada para medir la señal
- Tiempo de incubación insuficiente
- Optimizar los tiempos de incubación
- Cantidad de anticuerpo insuficiente
- Utilizar una mayor concentración de anticuerpo e incubarlo durante el tiempo recomendado
- Temperatura de los reactivos demasiado baja
- Comprobar que tanto el laboratorio como las placas y el resto de los reactivos no se encuentren a una temperatura demasiado baja
- La proteína diana está presente a una concentración muy baja en la muestra
- Incrementar la cantidad de muestra o utilizar reactivos de detección con mayor sensibilidad
Alto ruido de fondo
- Sobreincubación con el sustrato
- Reducir el tiempo de incubación
- Concentración de anticuerpo demasiado alta
- Reducir la concentración de anticuerpo
- Tiempo de bloqueo insuficiente
- Incrementar el tiempo de bloqueo o probar con soluciones de bloqueo diferentes
- Contaminación del control negativo
- Extremar el cuidado al pipetear para evitar la contaminación con otras muestras o reactivos del ensayo
- Lavado insuficiente de las placas
- Comprobar el número de lavados y el volumen de solución de lavado (al menos 400uL/pocillo)
- Incubación con el sustrato en ausencia de oscuridad
- Colocar la placa en oscuridad inmediatamente después de añadir el sustrato
- Sustrato degradado
- Comprobar que el sustrato no presenta color antes de ser añadido a la placa
Baja reproducibilidad
- Variación en los tiempos de incubación
- Mantener los mismos tiempos de incubación para todas las placas
- Variación en el número de lavados
- Aplicar el mismo número de lavados a todas las placas
- Errores al pipetear
- Extremar el cuidado al cargar la muestra y evitar la formación de burbujas en los pocillos
- Variaciones en la temperatura de los reactivos
- Asegurar que tanto los reactivos como los controles y las muestras se encuentran a la misma temperatura
- Revestimiento desigual
- Comprobar el procedimiento de revestimiento y utilizar placas adecuadas
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