Los inmunoensayos son técnicas ampliamente utilizadas tanto en investigación básica como en diagnóstico y aplicaciones clínicas. La idoneidad de los anticuerpos utilizados es crítica a la hora de obtener el resultado esperado, y esto no afecta únicamente al anticuerpo primario (que se unirá al antígeno de interés), sino también al anticuerpo secundario que nos permitirá la detección de esa unión.
Por lo tanto, es necesario prestar atención a algunos aspectos básicos que nos ayudarán a seleccionar los anticuerpos secundarios más apropiados para cada caso.
Seleccionar los anticuerpos secundarios: criterios a tener en cuenta
1. “Host” del anticuerpo primario:
El anticuerpo secundario debe ir dirigido contra la especie del primario, por lo que es fundamental conocer este dato. Si el anticuerpo primario se produjo, por ejemplo, en ratón, el secundario deberá ser un anti-ratón obtenido en una especie diferente a ésta.
2. Procedimiento experimental o técnica en la que se empleará:
Esta información es esencial a la hora de elegir el marcaje/conjugación de nuestro anticuerpo secundario
- Cuando la detección se lleve a cabo por reacción enzimática, como es el caso de técnicas como el Western Blot o el inmunoensayo ELISA, los anticuerpos secundarios deberán ir marcados con una enzima (Fosfatasa alcalina (AP), Peroxidasa (HRP)…) o bien conjugados a biotina para amplificación en dos pasos.
- Cuando la detección se lleve a cabo por fluorescencia, como ocurre en la Citometría de Flujo (FC), Inmunofluorescencia (IF), Inmunohistoquímica (IHC), Inmunocitoquímica (ICC)…, los anticuerpos secundarios deberán ir marcados con un fluorocromo.
3. Isotipo y subclase del anticuerpo primario:
El anticuerpo secundario irá dirigido contra el isotipo del anticuerpo primario. Aunque la gran mayoría de los anticuerpos primarios (sobre todo los anticuerpos policlonales) son IgGs, este es un aspecto al que prestar atención, siendo básico conocer el isotipo del anticuerpo primario, y recomendable su subclase en el caso de que la hubiera.
A modo de recordatorio, os dejamos un resumen con los distintos isotipos de las inmunoglobulinas en función de las especies más frecuentes:
4. Nivel de purificación del anticuerpo secundario
Los anticuerpos secundarios pueden presentarse como fracción IgG, o bien, como anticuerpos purificados por afinidad. Cada uno de estos dos formatos tiene sus ventajas y sus inconvenientes, que conviene conocer para poder hacer la elección más apropiada en cada caso.
- Fracción IgG: La principal ventaja de esta presentación es que la altísima afinidad de estos anticuerpos permitirá una mayor amplificación de la señal, facilitando la lectura de los resultados. Como contrapartida, la especificidad es menor, pudiendo dar lugar a uniones inespecíficas que resultarán en un elevado ruido de fondo.
- Anticuerpos purificados por afinidad: las principales ventajas en este caso serían la alta especificidad (con el consiguiente bajo nivel de background), alta sensibilidad y alta reproducibilidad de los inmunoensayos. Todo ello en detrimento de la afinidad, pudiendo dar lugar a reacciones más débiles.
Esperamos que esta breve guía os haya resultado de utilidad para ayudaros a seleccionar los anticuerpos secundarios que mejor se ajusten a vuestro ensayo.
¿Te ayudamos a encontrar los anticuerpos, proteínas o kits Elisa que necesitas?
Prueba gratis nuestro servicio
Entradas relacionadas:
- 5 diferencias entre anticuerpos primarios y secundarios
- Claves para seleccionar pares de anticuerpos
NEWSLETTER ¡No olvides suscribirte a nuestra newsletter aquí para recibir las actualizaciones semanales de este blog de investigación y anticuerpos!
