La conjugación de anticuerpos, también conocida como marcaje, es un paso necesario para la visualización y medición de los resultados en la mayoría de inmunoensayos. Dependiendo del nivel de antígeno o proteína de interés en la muestra, podemos proceder a un ensayo directo marcando el anticuerpo primario, o bien a un ensayo indirecto marcando el anticuerpo secundario.
En esta entrada, os traemos una visión general sobre la utilidad de los anticuerpos conjugados, los tipos de moléculas a los que más comúnmente se conjugan, y las químicas de conjugación que se emplean con más frecuencia.
Inmuniensayos directos Vs. Inmunoensayos indirectos
Los ensayos directos, donde el anticuerpo primario, el que se une directamente al antígeno, es el que va marcado y por lo tanto el que producirá la señal, son mucho más sencillos de ejecutar (con un menor número de incubaciones y lavados), y evitan posibles uniones inespecíficas que pueda dar el anticuerpo secundario.
Sin embargo, hay casos en los que los bajos niveles de proteína de interés en la muestra, nos obligan a recurrir a métodos que nos permitan amplificar la señal para poder detectarla. En estos casos, optaremos por un ensayo indirecto, utilizando un segundo anticuerpo que reconozca al anticuerpo primario unido al antígeno. En este caso, es este anticuerpo secundario el que deberá conjugarse para transformar la señal.
Si bien es cierto que los ensayos indirectos proporcionan una mayor sensibilidad al generar una señal más intensa, tienen el inconveniente de que, en general, la especificidad de los anticuerpos secundarios es mucho menor, pudiendo dar lugar a uniones inespecíficas no deseadas, por lo que en estos casos es necesario prestar especial atención a los pasos de bloqueo, lavado y controles adicionales.
¿Con qué tipo de moléculas puede hacerse la conjugación de anticuerpos?
En función del objetivo que vayamos buscando, los anticuerpos pueden conjugarse a moléculas tan dispares como enzimas, colorantes, fluoróforos, biotina, partículas de oro coloidal, etc. La elección del tipo de marcaje dependerá principalmente de la clase de inmunoensayo que se vaya a realizar.
(I) Enzimas
Se trata del método de detección más sencillo y económico. Al proceder a la conjugación de anticuerpos con una enzima, esta catalizará un sustrato presente en la muestra, originando una reacción colorimétrica visible. Las enzimas utilizadas con mayor frecuencia son la HRP (Horseradish Peroxidase) y la Fosfatasa alcalina (AP).
(II) Biotina / Estreptavidina
Se utiliza para detectar proteínas presentes en muy bajos niveles, insuficientes para ser detectadas ni siquiera mediante un anticuerpo secundario marcado, ya que la utilización de biotina / estreptavidina permite una mayor amplificación de la señal. El anticuerpo secundario suele ir marcado con biotina, una molécula de pequeño tamaño que permitirá la unión de varias de ellas a un mismo anticuerpo. Además, la biotina presenta una muy alta afinidad por la estreptavidina, lo que unido a lo anterior, posibilitará que la señal resultante se amplifique considerablemente.
(III) Fluorocromos
Los fluorocromos presentan un espectro único y característico de absorción y emisión, excitándose a una determinada longitud de onda y emitiendo fotones a otra diferente.
Es importante tener en cuenta que algunos fluoróforos convencionales como FITC, no están recomendados en protocolos que utilicen buffers con bajo pH, ya que su señal es altamente sensible a entornos ácidos.
Los fluorocromos presentan algunas ventajas frente a otros ligandos en cuanto a que la señal que producen es más intensa, permiten el multiplexado y su uso es relativamente sencillo.
Métodos de conjugación de anticuerpos
Los anticuerpos se conjugan mediante la unión covalente del grupo reactivo del ligando con el que se va a marcar, a un grupo reactivo presente en el anticuerpo. Existen infinidad de métodos y reacciones químicas para la conjugación de anticuerpos, aquí os citamos algunos de los más versátiles y utilizados:
- Ester NHS
- Reacción entre el ester NSH y una amina
- La reacción debe llevarse a cabo a un pH de entre 7,2 y 8
- Apto para conjugación de anticuerpos a fluorocromos
- No es necesario modificar previamente el anticuerpo
- Presenta el inconveniente de que el grupo NSH no es muy estable
- Rendimiento medio: 50-80%
- Isotiocianato
- Apto para conjugación de anticuerpos a fluorocromos
- La reacción debe llevarse a cabo a un pH de 9,8 o superior, lo que puede suponer una limitación ya que algunos anticuerpos podrían dañarse a pHs tan elevados
- La reactividad es más bien limitada
- Rendimiento medio: 50-80%
- Carbodiimida
- Reacción de una amina con un grupo carboxilo
- Se utiliza para la conjugación de anticuerpos a partículas carboxiladas (látex, beads magnéticas…) o a superficies carboxiladas (placas de micropocillos, chips…)
- La reacción debe llevarse a cabo a un pH de 5,5
- No es necesario modificar previamente el anticuerpo
- Presenta el inconveniente de que podrían producirse reacciones anticuerpo-anticuerpo
- Rendimiento medio: 50-80%
- Método de los dos tags
- Permite unir anticuerpos a moléculas de naturaleza proteica, ya que ambas presentan residuos de lisina que podrían dar lugar a reacciones indeseadas mediante otros métodos de conjugación. Con esta técnica se modifican esos residuos añadiendo tags diferentes a cada una de las dos moléculas.
- Requiere modificación del anticuerpo añadiéndole un tag (linker) antes de marcarlo
- Apto para enzimas y fluorocromos
- La reacción se lleva a cabo a un pH de 7-8
- Rendimiento medio: 20-50%
- Peryodato sódico
- Apto para enzimas y fluorocromos
- Reacción de una lisina con un grupo aldehído
- La unión es reversible a menos que se reduzca con cianoborohidruro sódico, reactivo catalogado como peligroso
- La reacción se lleva a cabo a un pH de 9
- Rendimiento medio: 70-80%
Sea cual sea el método de conjugación de anticuerpos empleado, existen dos elementos a los que se recomienda prestar especial atención:
1.- Buffers: La mayoría de los métodos de conjugación de anticuerpos se basan en la reacción con los residuos de lisina de las inmunoglobulinas. Por lo tanto, es importante evitar buffers y otros aditivos que contengan aminas primarias, ya que competirían por unirse al colorante con el propio anticuerpo.
2.- Pureza del anticuerpo: Para llevar a cabo una reacción de conjugación de anticuerpos, estos deberían tener una pureza mayor al 90% y una concentración de al menos 0,5 mg/ml.
Confiamos en que esta visión general en torno a la conjugación de anticuerpos os haya resultado de interés. Y como siempre, no dudéis en contactar con nosotros para cualquier consulta que necesitéis aclarar al respecto.
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